實時熒光定量PCR檢測結(jié)直腸腺癌患者組織中廣泛型線粒體肌酸激酶基因的表達(dá)

羅喜俊，何嘉琳，梁俊杰，朱顯軍，梁偉雄，唐興奎

(廣州市番禺中心醫(yī)院消化中心二區(qū)，廣東 廣州 511400)

一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的能量緩沖以及能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)則是由線粒體肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase，MtCK)、細(xì)胞漿型的CK、Cr、PCr等共同組成的，也就是我們所說的CK/PCr循環(huán)，其對細(xì)胞和組織的代謝有著非常重要的影響[1]。在機體內(nèi)，MtCK存在與線粒體膜上，其與胞漿型的腦型肌酸激酶(CK-BB)、肌型肌酸激酶(CK-MM)等一起被稱為肌酸激酶同工酶家族，不但能夠?qū)θ姿嵯佘?ATP)與肌酸之間的高能磷酸鍵的可逆轉(zhuǎn)移起到催化的作用，使得ATP含量增加，還參與了能量代謝和肌肉收縮的過程。根據(jù)亞型不同其又被分成了廣泛亞型(uMtCK)和肌膜型亞型(sMtCK)。研究表明，腫瘤患者血清中uMtCK檢出率較高，這也進(jìn)一步說明了uMtCK的高表達(dá)與腫瘤高度的能量需求有著密切的關(guān)系[2]。本研究重點分析實時熒光定量PCR檢測結(jié)直腸腺癌患者組織中uMtCK基因的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年12月在我院治療的98例結(jié)直腸腺癌患者作為研究對象，其中男58例，女40例；年齡37～77歲，平均年齡(58.52±2.14)歲；結(jié)腸癌36例、直腸癌62例。另選取同期100例健康體檢者作為對照組，其中男53例，女47例；年齡36～75歲，平均年齡(57.39±2.09)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，均簽署知情同意書且自愿參與研究。

1.2 方法

實時熒光定量PCR檢測患者腫瘤組織及癌旁組織uMtCK mRNA的表達(dá)。(1)制備腫瘤組織細(xì)胞總RNA：將放在液氮中的腫瘤組織取出，提取其中的RNA，按照操作說明書嚴(yán)格的執(zhí)行此項操作。通過瓊脂糖凝膠電泳法，采用紫外分光光度儀對提取出來的RNA質(zhì)量以及濃度進(jìn)行檢測，進(jìn)而計算出RNA的含量。(2)制備定量陽性模板，以RNA為模板，采用RT-PCR法擴增出大小為208 bp的RNA序列，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，與pMD18-T載體進(jìn)行連接，將其轉(zhuǎn)化后的結(jié)果接入到JMI109中，對PCR的陽性率進(jìn)行鑒定，同時對其進(jìn)行克隆和測序驗證，最終得到人uMtCK片段的重組質(zhì)粒pMD18-T-uMtCK。將重組質(zhì)粒與GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品以1∶10的比例進(jìn)行稀釋，并制作出各種濃度不同的模板[3]。(3)實時熒光定量PCR檢測：取腫瘤組織和癌旁組織中總RNA不同的稀釋度uMtCK陽性模板，將模板放在定量儀上進(jìn)行擴增，此項操作所需要的反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件均與上述相同。擴增反應(yīng)結(jié)束后，采用計算機系統(tǒng)將本次得到的曲線與正常人的曲線進(jìn)行對比，在此基礎(chǔ)上結(jié)合內(nèi)參得到各患者的uMtCK基因表達(dá)拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗進(jìn)行比較，P<0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA的純度和濃度

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示18S、28S兩條帶，且后者的亮度約是前者的2倍，提示本次抽取的RNA比較完整。紫外分光光度儀結(jié)果顯示，RNA的濃度為1.8～2.2。

2.2 RT-PCR擴增片段以及pMD18-T-uMtCK質(zhì)粒的鑒定

以本次提取的腫瘤組織總RNA為模板，經(jīng)測序后證明pMD18-T-uMtCK質(zhì)粒序列與Genebank上的序列一致。

2.3 結(jié)直腸腺癌與健康者uMtCK mRNA比較

腫瘤組織中均存在uMtCK mRNA表達(dá)，其范圍為7.5×105～5.3×108拷貝μgRNA，平均(9.2±5.8)×106拷貝μgRNA；癌旁組織中的uMtCK基因表達(dá)為4.4×103～6.8×105拷貝μgRNA，平均(8.5±3.2)×104拷貝μgRNA。上述結(jié)果均高于健康者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

MtCK屬于肌酸激酶家族成員，一般位于線粒體膜上，在線粒體呼吸、控制中有著重要意義[4、5]。當(dāng)MtCK處于有氧狀況，就會通過磷酸肌酸穿梭機制為肌肉收縮提供所需的能量，這也是保證細(xì)胞正常代謝的一種關(guān)鍵酶，從其分子形式上看，其與CK同工酶相同[6]。但是在氨基酸的組成，電泳性質(zhì)、免疫性質(zhì)等方面，其與CK同工酶卻存在著較大的差異[7]。

正常人的血清中并不會出現(xiàn)MtCK的表達(dá)，但大多數(shù)惡性腫瘤患者血清中會出現(xiàn)uMtCK過表達(dá)。導(dǎo)致腫瘤患者血清中uMtCK過表達(dá)的原因可能是：(1)腫瘤細(xì)胞代謝速度的加快，也加快了腫瘤組織的增生速度，使得機體需要為其提供大量的能量，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中uMtCK含量增加[8]；(2)腫瘤細(xì)胞在快速生長、快速增生，也在快速壞死，MtCK漏入到了血液循環(huán)中，增高了血液中MtCK的活性；(3)患者在經(jīng)過大量的化療藥物治療后，進(jìn)而破壞了腫瘤細(xì)胞，使得一部分MtCK漏入在了血液中，導(dǎo)致血液中MtCK的活性增高[9]。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸腺癌患者腫瘤組織中均存在uMtCK mRNA表達(dá)，其范圍為7.5×105～5.3×108拷貝μgRNA，平均(9.2±5.8)×106拷貝μgRNA；癌旁組織中的uMtCK基因表達(dá)為4.4×103～6.8×105拷貝μgRNA，平均(8.5±3.2)×104拷貝μgRNA。上述結(jié)果均高于健康者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這也可能是由于腫瘤中需要高能量的轉(zhuǎn)換，且通過凋亡并不能較好消除腫瘤細(xì)胞而造成的。

綜上所述，結(jié)直腸腺癌uMtCK mRNA含量升高，這為提高臨床診斷準(zhǔn)確率提供了有價值的依據(jù)，實時熒光定量PCR檢測結(jié)直腸腺癌uMtCK基因表達(dá)，其最終結(jié)果可采用絕對拷貝數(shù)表示，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠[10]。