肝癌免疫微環(huán)境及免疫治療最新進展

何其寬，葉志宇，陳曉崗

（寧波市第一醫(yī)院 普外科，浙江 寧波 315000）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為最常見的原發(fā)性肝癌（占70%～90%），據(jù)統(tǒng)計全球每年新增HCC至少有70萬例[1]，僅我國就占到了其中一半。HCC主要的致病因素包括有：乙肝病毒、丙肝病毒、飲酒、糖尿病及一些代謝性疾病[2]。目前臨床關(guān)于HCC的治療選擇，對于早期局部肝癌患者，可采用局部手術(shù)切除、肝移植、射頻消融及經(jīng)動脈化療栓塞。由于早期無特異性表現(xiàn)，很多HCC患者在中晚期才能被確診。而對于中晚期肝癌，通常采用全身藥物治療以尋求手術(shù)機會，最具代表性的是抑制血管生成的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）：索拉菲尼、樂伐替尼、瑞格非尼[3]。然而，由于藥物耐受等原因，TKIs的治療效果有限[4]。肝臟是機體最大的免疫器官，內(nèi)部存在各種免疫細胞，HCC作為典型的炎癥相關(guān)腫瘤，免疫耐受及逃避機制在癌癥進展中發(fā)揮著重要作用[5]。在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中，癌細胞、細胞因子、免疫細胞、非腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)構(gòu)成了一個動態(tài)系統(tǒng)，它們相互作用，產(chǎn)生生長因子、細胞因子和趨化因子來參與免疫抑制，從而促進肝癌細胞的進展[6]。其中，更有免疫抑制細胞通過分泌及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用進一步驅(qū)動免疫逃避。在本文中，我們將闡述肝癌相關(guān)免疫抑制成分及潛在的免疫治療措施。

1 HCC腫瘤微環(huán)境中具有代表性的免疫抑制成分

1.1 骨髓來源抑制細胞（marrow-derived suppressor cells，MDSCs）

在HCC中，骨髓細胞分化為一組未成熟的髓樣細胞，具有很強的免疫抑制活性并影響抗原呈遞細胞功能[7]。MDSCs具有顯著的多樣性和可塑性，在不同環(huán)境中可以分化為巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等。MDSCs在肝癌TME中主要通過以下幾個途徑發(fā)揮免疫抑制作用：（1）誘導(dǎo)并擴增調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs），減輕效應(yīng)T細胞功能；（2）抑制樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）與自然殺傷細胞（natural killer，NK）極化狀態(tài)，以及控制巨噬細胞向M2表型的轉(zhuǎn)變；（3）消耗T細胞必需氨基酸，誘導(dǎo)其凋亡；（4）誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。腫瘤來源的細胞因子（如G-CSF、GM-CSF、VEGF、MCP-1、IL-1β等）可以進一步誘導(dǎo)MDSCs的浸潤，其中肝臟內(nèi)源性細胞周期相關(guān)激酶（cell cycle related kinase，CCRK）可以通過EZH2/NF-κB信號通路上調(diào)白介素6（IL-6）的產(chǎn)生[8]，誘導(dǎo)MDSCs在TME中聚集。同時，腫瘤細胞增殖期間造成局部缺氧狀態(tài)，可以進一步促進MDSCs的積累，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）被證實能夠介導(dǎo)HCC細胞中CD39L1過表達以增加細胞外5’-AMP水平[9]，促進MDSCs進入TME。總之，由于MDSCs具有促進腫瘤及免疫抑制作用，可以將其作為HCC治療的特異性靶點，并為緩解HCC進展提供可能的輔助療法。

1.2 腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）

巨噬細胞起源于骨髓細胞來源的單核細胞，在不同環(huán)境刺激下巨噬細胞主要以M1和M2狀態(tài)存在。有研究證實，交替激活狀態(tài)的巨噬細胞可以刺激腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[10]。此外，作為骨髓來源細胞，TAMs可以通過分泌細胞因子和趨化因子，抑制腫瘤免疫能力并促進腫瘤進展。在HCC中，一些特異性免疫抑制TAMs已經(jīng)成為近年來的研究熱點。已知HCC來源的細胞因子如白介素4（IL-4）、白介素13（IL-13）、集落刺激因子1（CSF-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、結(jié)締組織生長因子等可以誘導(dǎo)相關(guān)炎性單核細胞分化為TAMs，或者激活巨噬細胞浸潤，進一步降低先天性免疫及后天適應(yīng)性免疫。據(jù)報道，肝癌細胞可以分泌一種叫作骨橋蛋白的非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白，它與肝癌組織中PD-L1表達呈正相關(guān)，而且可以通過CSF1-CSF1受體途徑促進肝癌中TAMs選擇性活化以及趨化遷移[11]。MDSCs與TAMs之間相互作用可促進IL-10表達上升，IL-10作為一種強免疫抑制介質(zhì)，能夠抑制下游CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒性作用。HCC中TAMs衍生的IL-10還可以增加腫瘤內(nèi)Tregs的數(shù)量，從而抑制效應(yīng)T細胞的活化。肝癌細胞周圍基質(zhì)中的巨噬細胞可以分泌多種炎癥因子，其中IL-17可以介導(dǎo)CD4+T輔助細胞的擴增，后者可過表達多種腫瘤活化標志物來抑制抗腫瘤免疫作用[12]。TAMs還參與了其他免疫調(diào)節(jié)機制：轉(zhuǎn)化生長因子-β可以活化HCC中的TAMs，活化的TAMs通過NF-κB信號通路激活下游IL-6表達，促進腫瘤生長和免疫耐受，而IL-6/STAT3信號通路還被證實可以促進腫瘤干細胞來進一步維持HCC的發(fā)生[13]。

1.3 腫瘤相關(guān)中性粒細胞（tumor associated neutrophils，TANs）

作為骨髓分化來源的又一類細胞，TANs與MDSCs、TAMs對HCC進展都具有促進作用。此外，TANs不僅能夠促進腫瘤生長，還具有抗腫瘤生長作用。和巨噬細胞類似，TANs也可分為兩個細胞亞型，即N1亞型（抗腫瘤型）和N2亞型（促腫瘤型），分別通過腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來進一步發(fā)揮作用。TANs不同亞型的可塑性主要受轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的影響；TGF-β可以將TANs極化到N2表型，而抑制TGF-β與干擾素β（IFN-β）表達則可以誘導(dǎo)N1表型[14]。在腫瘤微環(huán)境中，TANs可以通過釋放細胞生長因子來促進或者抑制腫瘤的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，HCC細胞及其TANs可激活患者外周血中性粒細胞，從而分泌細胞因子趨化因子配體2（CCL2）和趨化因子配體17（CCL17）。CCL2、CCL17與腫瘤大小、微血管浸潤、腫瘤分化和分期等有關(guān)[15]。而且，CCL2和CCL17可以進一步促進HCC細胞、巨噬細胞和Tregs的遷移活性。綜上，TANs可將巨噬細胞和Tregs細胞募集到肝癌細胞中，促進HCC生長和進展。

1.4 調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）

Tregs主要來源于外周T淋巴細胞、常駐T細胞以及其他細胞來源。Tregs不僅可以限制機體自身免疫反應(yīng)，還可以抑制機體對微生物和病毒抗原、過敏原、腫瘤以及同種異體移植物的反應(yīng)。T細胞受體與IL-10及TGF-β結(jié)合，激活信號通路活化Tregs。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）也對Tregs的激活起到關(guān)鍵作用，其中過表達的長鏈非編碼表皮生長因子受體（lnc-EGFR）與EGFR結(jié)合后可阻止Tregs因泛素化作用而降解，從而促進Tregs在HCC中發(fā)揮免疫抑制作用[16]。在HCC患者中，Tregs的含量是顯著上升的，其與腫瘤細胞的侵襲性密切相關(guān)[17]。因此可以推測，Tregs的水平與HCC的進展有關(guān)，并有可能成為HCC一個可靠的預(yù)測指標或免疫治療的潛在靶點。

1.5 腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）

成纖維細胞與癌細胞之間的作用至關(guān)重要，它可以通過分泌各種生長因子及細胞因子來促進腫瘤的增殖、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移；而這些與癌細胞相互聯(lián)系的成纖維細胞被稱之為CAFs。Kanto等[18]發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）在HCC腫瘤微環(huán)境中作為CAFs的主要功能調(diào)節(jié)器之一，其內(nèi)源性或外源性的產(chǎn)生都可以促進肝臟CAFs分泌細胞因子，增強肝癌細胞侵襲能力。HCC來源的成纖維細胞通過滅活NK細胞，使得NK細胞在TME處于無反應(yīng)狀態(tài)，從而為肝癌的進展提供了有利的條件。此外，CAFs還可以通過IL-6介導(dǎo)的STAT3信號通路激活并募集調(diào)節(jié)性DCs至TME中，而TME中分泌的TGF-β可以使其轉(zhuǎn)化為免疫耐受型DCs，并進一步上調(diào)Tregs的產(chǎn)生[19]?？傊?，CAFs在HCC細胞的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，靶向抑制CAFs也有望能有效緩解甚至阻止HCC的進程。

1.6 腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）

腫瘤中高密度的TILs被認為是機體對癌細胞免疫反應(yīng)的結(jié)果。早期臨床數(shù)據(jù)表明，肝癌患者術(shù)后高水平的淋巴細胞浸潤，尤其是T細胞浸潤可以有效降低復(fù)發(fā)率并提高患者生存率。但是，越來越多的證據(jù)證明，HCC患者中總的TILs浸潤程度并不能有效提高自身免疫來控制腫瘤的進展。肝內(nèi)免疫反應(yīng)涉及到不同的淋巴細胞亞群，它們對HCC的免疫檢測能力不同。其中最典型的就是Tregs與細胞毒性T細胞，兩者之間的差異將決定TILs對HCC所起到的免疫作用[20]。

2 現(xiàn)階段HCC免疫治療策略

2.1 免疫節(jié)點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）

ICIs是一種特殊的膜結(jié)合分子，在腫瘤免疫逃避機制中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在HCC中，最常見的ICIs包括程序性細胞死亡蛋白及其配體（PD-1，PD-L1）、細胞毒性T淋巴細胞蛋白4（CTLA-4）、淋巴細胞活化基因3蛋白（LAG-3）和含黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3（Tim-3）。PD-1是調(diào)節(jié)CD4+、CD8+T細胞、B細胞和NK細胞表達的調(diào)節(jié)性免疫球蛋白，在維持T淋巴細胞的免疫耐受和抑制免疫細胞活性中起重要作用。在HCC中，循環(huán)系統(tǒng)和腫瘤內(nèi)PD-1+CD8+T細胞的增加預(yù)示著術(shù)后復(fù)發(fā)及不良預(yù)后，多種細胞因子尤其是IFN-γ誘導(dǎo)癌細胞PD-L1的上調(diào)進而削弱機體抗腫瘤免疫力，促進HCC進展[21]?，F(xiàn)階段臨床研究的PD-1抑制劑納武單抗（Nivolumab）、派姆單抗（Pembrolizumab）、度伐單抗（Durvalumab）在HCC中已被證實了有效的治療作用。CTLA-4是一種活化的T細胞表達的抑制性共受體，主要存在于Tregs上，其在控制CD4+T細胞功能中起著關(guān)鍵作用。在HCC中，CTLA-4可以抑制腫瘤相關(guān)抗原識別和分化的T細胞增殖，通過誘導(dǎo)Tregs的活性和IL-10的產(chǎn)生進一步介導(dǎo)免疫抑制作用。目前，CTLA-4的特異性抑制劑替西木單抗（Tremelimumab）在改善HCC患者生存時間上有著明顯的作用[22]。Tim-3是一種跨膜蛋白，可在分泌IFN-γ的Th1細胞、NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞上表達，它可與可溶性配體半乳糖凝集素9（Galectin-9）相互作用負性調(diào)節(jié)T細胞作用。LAG-3是免疫球蛋白超蛋白家族的成員之一，其以高親和力和II類MHC分子結(jié)合，從而抑制T細胞的共刺激作用，來達到促癌作用。現(xiàn)階段，有關(guān)Tim-3和LAG-3抑制劑在臨床上的治療價值還需要進一步闡明。

2.2 過繼細胞療法（adoptive cell transfer，ACT）

近年來，基于細胞的免疫療法在實體腫瘤治療中得到了一定的發(fā)展。其中，ACT為癌癥治療提供了有效而持久的抗腫瘤免疫能力。根據(jù)細胞類型，在HCC中使用的ACT療法分為兩種：一種是細胞因子誘導(dǎo)殺傷（cytokine-induced Killer，CIK）細胞療法，另一種是嵌合抗原受體修飾的T細胞（CAR-T）療法。CIK細胞是一系列T淋巴細胞的混合物，可以從外周單核細胞中獲取，且容易培養(yǎng)。與細胞毒性T淋巴細胞相比，由于沒有MHC限制，CIK細胞對腫瘤細胞具有更好的殺傷效果。CIK細胞還可以通過NKG2d配體相互作用，有效殺傷腫瘤干細胞，改善HCC患者生存時間。CIK細胞作為一種有效的ACT免疫療法，為HCC的治療提供了一種全新的選擇。然而，部分接受治療的患者存在“免疫疲勞”以及缺少足夠白細胞的情況[23]，這也是CIK細胞治療有待克服的一個缺陷。另一種ACT療法，是基于CAR-T，其在HCC治療中也具有一定療效。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC-3）是一類在肝癌細胞膜上的癌胚蛋白多糖，可以促進HCC的進展，且與HCC不良預(yù)后有關(guān)。研究表明，細胞毒性T細胞活性與靶細胞中GPC-3的表達呈正相關(guān)[24]，靶向GPC-3的CAR-T細胞為GPC-3+的HCC提供了新的免疫干預(yù)措施?；贏CT的治療為HCC的免疫治療提供了新的途徑。然而，在被廣泛用作臨床治療藥物前，它們在臨床的療效和腫瘤脫靶毒性仍需要進一步評估。

2.3 HCC非細胞免疫和溶瘤病毒免疫治療

隨著越來越多腫瘤相關(guān)抗原的鑒定，AFP、GPC-3、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）等多種腫瘤抗原已被確定為HCC免疫治療的靶點。早期HCC-AFP疫苗在臨床試驗中可以檢測到短暫的免疫作用；從TERT衍生而來的一種16個氨基酸組成的多肽疫苗（GV1001）[25]，它可以結(jié)合多個人類白細胞抗原復(fù)合物II分子，從而抑制腫瘤活性；GPC-3相關(guān)的疫苗可誘導(dǎo)HCC抗腫瘤作用，并延長患者總體生存時間。除了這些經(jīng)典的腫瘤相關(guān)抗原外，還有一個潛在的新靶點即睪丸癌相關(guān)抗原（cancer-testis antigens，CTAs）[26]，由于CTAs在多種腫瘤和正常組織中的表達模式受到了一定的限制，它被認為是HCC免疫治療的新靶點。溶瘤病毒可選擇性地在腫瘤細胞中復(fù)制，殺傷腫瘤細胞并特異性地在腫瘤組織中傳播，而不損傷正常細胞。對于HCC免疫治療的溶瘤病毒，有報道多種治療基因重組的溶瘤腺相關(guān)病毒（adenoassociated viruses，AAVs）可以在肝癌細胞中發(fā)揮特異性殺傷作用。另外還有一種重組的AAVs模型，即含有hTERT和TNF-α相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因的AAVs載體，它以肝癌細胞端粒酶為靶點發(fā)揮了特異的細胞毒性和凋亡作用，抑制HCC的生長?？偟膩碚f，非細胞疫苗及溶瘤病毒是有效的腫瘤治療藥物，這有助于進一步擴大HCC免疫治療的選擇。

3 結(jié)論

免疫耐受是導(dǎo)致HCC病死率居高不下、治療效果不佳、預(yù)后差等不良后果的主要原因之一。在HCC中，包括MDSCs、TAMs、TANs、Tregs、CAFs和TILs等在內(nèi)的免疫抑制細胞是TME的重要組成成分，它們與癌細胞、細胞外基質(zhì)等共同組成了腫瘤微環(huán)境，從而抑制了免疫細胞的抗腫瘤活性，對促進HCC生長和侵襲也發(fā)揮著重要的作用。這些免疫細胞的分化、成熟及功能的發(fā)揮還受到細胞因子及其它化學因子的調(diào)節(jié)。因此，我們迫切需要開發(fā)針對這些免疫抑制細胞的治療方法。本文也介紹了一系列相關(guān)的免疫療法，包括ICIs、ACT療法、非細胞免疫療法和溶瘤病毒免疫療法等。然而，很多免疫相關(guān)療法尚處于試驗階段，仍需要進一步的臨床驗證?？偟膩碚f，免疫治療有望成為治療HCC最有前景的方法之一，隨著不斷的研究探索，我們相信免疫治療還可以變得更加有效。