苦蕎黃酮提取方法的研究及含量測定分析

孫亞利，周文美＊，趙天明，李向東，王小平

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院 發(fā)酵工程與生物制藥省重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025；3.貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴陽 550025）

苦蕎麥，別名菠麥、花蕎等，起源于我國西南部，栽培于我國東北、內蒙、河北、山西、陜西、甘肅、青海、四川、云南等地，亞洲、歐洲和北美也有栽培［1，2］。

苦蕎麥有“五谷之王”的美稱，是藥食兩用的良藥佳肴?！侗静菥V目》記載：“苦蕎味苦，性平寒，能實腸胃，益氣力，續(xù)精神，利耳目，煉五臟渣穢”［3］。苦蕎麥富含黃酮、氨基酸、膳食纖維、多糖、多酚等活性成分，其中黃酮類化合物具有顯著的抗氧化功效，可以防治多種慢性疾病，在食品加工中廣泛用于各種糕點、調味食品、保健食品等的生產，深受人們的喜愛［4－8］。

閆斐艷［9］、王廷璞等［10］、李朋等［11］曾分別采用熱水浸提、乙醇提取、索氏提取等方法對苦蕎總黃酮含量進行了探究，綜合分析可得：熱水浸提法得率最低，為0.44%，且產物純度低，不易保存；乙醇提取法耗時太長，不利于高效作業(yè)；索氏提取法最優(yōu)提取率為1.462%，但其適用規(guī)模太小，無法投入生產，相比而言，超聲和微波提取法利用機械效應、空化效應、熱效應和電磁場作用［12，13］，可有效輔助乙醇浸提法，實現生物有效成分的快速分離。本實驗以貴州苦蕎為研究對象，對超聲波和微波輔助醇提法提取苦蕎麥總黃酮的工藝條件進行了優(yōu)化，探討了苦蕎麥中黃酮類化合物的提取和測定方法，以期為苦蕎麥黃酮類化合物的進一步研究、開發(fā)和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦蕎麥：2017年9月采集于貴州省貴陽市白云區(qū)；蕓香苷標準物質：貴州迪大生物科技有限責任公司；無水乙醇、三氯化鋁、乙酸鉀（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；甲醇、磷酸（均為色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限責任公司。

101-1型電熱鼓風干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HC-280T2高速多功能粉碎機 永康市綠可食品機械有限公司；PS-100A超聲波清洗器 東莞市潔康超聲設備有限公司；ORW2S-5H微波設備 南京澳潤微波科技有限公司；島津UV-2550紫外可見分光光度計 廈門儀宸科技有限公司；Agilent 1260 Infinity LC高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕓香苷標準曲線的繪制

按李欣等的AlCl3法［14］，測定吸光度，以吸光度為橫坐標、蕓香苷質量濃度（mg／mL）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程y＝0.0292x＋1.2738E-5，r＝0.99956。

1.2.2 苦蕎麥中總黃酮的制備

樣品的前處理：將苦蕎麥置于45℃烘箱中，烘干過夜，取出適量于粉碎機中粉碎，過100目篩，放入自封袋中，備用。

超聲提取法：準確稱取1g苦蕎麥粉末，與一定量乙醇混合，在不同提取溫度下，超聲波功率500W，持續(xù)一段時間后；4℃、5000r／min離心15min，取上清液經0.45μm濾膜過濾得到總黃酮提取液。

微波提取法：準確稱取1g苦蕎麥粉末，與一定量乙醇混合，微波功率300W，持續(xù)一段時間后；4℃、5000r／min離心15min，取上清液經0.45μm濾膜過濾得到總黃酮提取液。

在較低溫度超聲提取時，應注意循環(huán)換水，以防因機器工作造成溫度升高；微波提取時，要注意調節(jié)冷凝水的流速，防止提取液噴出；應小心緩慢取出離心管中上清液，避免有沉淀倒出。

1.2.3 苦蕎麥中總黃酮含量的測定

取1mL樣品待測液于10mL容量瓶中，用AlCl3法測其吸光度，計算苦蕎麥中總黃酮的含量。根據回歸方程求得相應苦蕎黃酮濃度，按下式計算總黃酮得率：

1.2.4 HPLC色譜條件［15－19］

色譜柱：Agilent TC C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-0.3%磷酸溶液（47∶53，V／V）；柱溫：30℃；檢測波長：257nm；流速：1.0mL／min；進樣量：10μL。重復6次。

1.2.5 苦蕎蕓香苷HPLC分析

蕓香苷對照品溶液的制備：準確稱取蕓香苷0.010g，用色譜級甲醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，制成1mg／mL蕓香苷對照品貯備液。準確稱取苦蕎麥粉1g，根據1.2.2待測液的制備方法處理，離心，取1.5mL上清液，0.22μm濾膜過濾備用。本實驗于2018年5月～6月，分別在貴州大學和貴陽理工學院完成。

1.3 實驗設計

分別考察了乙醇質量分數、料液比、超聲時間、微波時間及超聲溫度對苦蕎黃酮得率的影響，采用L9（34）正交設計，確定超聲波輔助醇提法和微波輔助醇提法的最佳工藝參數，并對這2種方法進行分析比較。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇質量分數對苦蕎總黃酮得率的影響

圖1 乙醇質量分數對苦蕎黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on the yield of tartary buckwheat flavonoids

由圖1可知，隨著乙醇質量分數的提高，苦蕎總黃酮得率先增加后減少，當乙醇濃度達到60%和50%時，超聲、微波提取總黃酮得率最高，繼續(xù)增加乙醇濃度，總黃酮得率下降，可能是其他醇溶性雜質、色素等溶出，造成黃酮溶解度降低，得率減?。?0］。故超聲提取、微波提取的最佳乙醇濃度分別為60%和50%。

2.1.2 料液比對苦蕎總黃酮得率的影響

圖2 料液比對苦蕎總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on the yield of total flavonoids in tartary buckwheat

由圖2可知，隨著料液比的減小，總黃酮得率先增加后減少；當料液比達到1∶30時，總黃酮得率最高，其主要原因可能是料液比大時不能使苦蕎黃酮充分溶解，料液比小時苦蕎黃酮濃度過小，進而影響總黃酮得率。綜上，在超聲提取和微波提取實驗中，最佳料液比均為1∶30。

2.1.3 提取時間對苦蕎總黃酮得率的影響

圖3 超聲時間和微波時間對苦蕎總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time and microwave time on the yield of total flavonoids in tartary buckwheat

由圖3可知，隨著提取時間增加，總黃酮得率先增加后減少；當超聲時間、微波時間分別為40，2min時，總黃酮得率最高；繼續(xù)延長提取時間不利于得率的提升?？赡苁怯捎谔崛r間增加，熱量聚集，造成黃酮結構改變，得率減小。綜上，確定超聲、微波提取最佳時間分別為40min和2min。

2.1.4 超聲溫度對苦蕎總黃酮得率的影響

圖4 溫度對苦蕎總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of total flavonoids in tartary buckwheat

由圖4可知，提取溫度在40℃內，苦蕎黃酮溶解度隨溫度的升高而增大；超過40℃后，黃酮得率變化不顯著（p＞0.05），這可能是因為當溫度過高時，蛋白質析出，造成黏度增大，進而影響了黃酮物質的析出。因此選擇40℃為最佳超聲提取溫度。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 超聲波輔助醇提法

在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇質量分數、料液比、溫度、時間4個因素，采用L9（34）正交試驗考察各因素對苦蕎黃酮提取效果的影響，確定超聲提取的最佳工藝，并對結果進行方差分析和顯著性檢驗，正交試驗結果見表1，方差分析見表2。

表1 超聲提取正交試驗結果Table1 Ultrasonic extraction orthogonal test results

表2 超聲提取正交試驗方差分析Table2 Analysis of variance of ultrasonic extraction orthogonal test

由表1和表2可知，4個因素均對總黃酮得率有極顯著影響，各因素對總黃酮得率影響的程度為：乙醇質量分數＞料液比＞提取時間＞提取溫度，超聲提取的最優(yōu)，工藝為A3B2C2D1，即乙醇質量分數為70%，料液比為1∶30，提取時間為30min，提取溫度為40℃，平均得率為2.35%。

2.2.2 微波輔助醇提法

在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇質量分數、料液比、時間3個因素，采用L9（34）正交試驗考察各因素對苦蕎黃酮提取效果的影響，確定微波提取的最佳工藝，并對結果進行方差分析和顯著性檢驗，正交試驗結果見表3，方差分析見表4。

銀行貸款方面，雖然目前我國很多銀行都有了自己的小額信貸部門，但從小微企業(yè)通過銀行貸款融資的過程和結果看，依然很受“歧視”。原因包括：

表3 微波提取正交試驗結果Table3 Microwave extraction orthogonal test results

表4 微波提取正交試驗方差分析Table4 Analysis of variance of microwave extraction orthogonal test

由表3和表4可知，3個因素均對總黃酮得率有極顯著影響，影響程度為：乙醇質量分數＞提取時間＞料液比，微波提取最優(yōu)工藝為A3B3C1，即乙醇質量分數為60%，提取時間為1min，料液比為1∶40，平均得率為2.47%。

通過正交試驗結果分析可得，微波提取總量高于超聲提取，且差異顯著（p＜0.05），而且微波提取大大節(jié)省了時間。

2.3 苦蕎總黃酮含量的測定

2.3.1 精密度試驗

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，按1.2.3節(jié)測定吸光度，連續(xù)測定6次，得精密度為1.13%，精密度試驗符合要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，按1.2.3節(jié)分別于15，30，45，60，75，90min測定吸光度，結果見表5。

表5 總黃酮穩(wěn)定性試驗Table5 The stability test of total flavonoids

超聲提取與微波提取的RSD分別為0.73%和0.97%，即2種提取法在90min內總黃酮量基本不變，穩(wěn)定性良好，符合試驗要求。

2.3.3 重現性試驗

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，按1.2.3節(jié)測定吸光度，結果見表6。

表6 總黃酮重現性試驗Table6 The reproducibility test of total flavonoids

超聲提取與微波提取的RSD分別為1.31%和1.46%，重現性良好，符合試驗要求。

2.3.4 回收率試驗

精確稱取苦蕎麥粉1.0g，用于超聲提取和微波提取的樣品中分別加入40mL乙醇和1mL蕓香苷標準品溶液（質量濃度為1.6mg／mL）。按上述超聲提取和微波提取的最優(yōu)工藝條件制備各樣品溶液，重復5次，計算總黃酮得率，確定回收率，結果見表7。平均回收率分別為103.06%和101.11%，符合試驗要求，兩者回收率差異不顯著（p＞0.05）。

表7 總黃酮回收率Table7 The recovery of total flavonoids

續(xù) 表

2.4 蕓香苷的HPLC含量測定結果

2.4.1 蕓香苷標準曲線的制作

以蕓香苷進樣量（μg／mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制蕓香苷標準曲線，得線性回歸方程為y＝1607.32848x－1.0414，r＝0.99998，蕓香苷含量在1～20μg／mL范圍內呈線性關系，見圖5和圖6。

圖5 蕓香苷標準品色譜圖Fig.5 Chromatogram of rutin standard

圖6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of the sample

2.4.2 精密度試驗

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，連續(xù)進樣6次，按1.2.4節(jié)測定蕓香苷含量，得精密度為1.05%，精密度良好，符合試驗要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，每隔1h進樣10μL，按1.2.4節(jié)測定蕓香苷含量，結果見表8。超聲提取與微波提取的RSD分別為1.32%和1.31%。即2種提取法在6h內蕓香苷含量基本不變，穩(wěn)定性良好，符合試驗要求。

表8 蕓香苷穩(wěn)定性試驗Table8 The stability test of rutin

2.4.4 重現性試驗

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，平行6次，按1.2.4節(jié)測定蕓香苷含量，結果見表9。超聲提取與微波提取蕓香苷含量分別為1.141%和1.193%，RSD分別為1.43%和1.13%，重現性良好，符合試驗要求。

表9 蕓香苷重現性試驗Table9 The reproducibility test of rutin%

2.4.5 回收率試驗

按2.4.4節(jié)制備回收率試驗樣品，依據1.2.4節(jié)測定蕓香苷含量，確定回收率，結果見表10。平均回收率分別為103.61%和100.16%，兩者回收率接近，微波的效果略好于超聲波，且差異顯著（p＜0.05）。

表10 蕓香苷回收率Table10 The recovery of rutin

3 結論

由正交結果及方差分析可知，超聲提取苦蕎總黃酮的最優(yōu)工藝為乙醇質量分數70%、料液比1∶30、提取時間30min、提取溫度40℃，影響程度為：乙醇質量分數＞料液比＞提取時間＞提取溫度，4個因素均對總黃酮得率有極顯著影響。微波提取最優(yōu)參數為：乙醇質量分數60%、提取時間1min、料液比1∶40，影響主次為：乙醇質量分數＞提取時間＞料液比，均對總黃酮得率有極顯著影響。

超聲波輔助醇提法與微波輔助醇提法相比，微波提取黃酮得率更高，而且微波輔助醇提法 大大減少了生產周期，提高了產品得率。

采用HPLC法測定苦蕎蕓香苷含量，結果表明：超聲提取蕓香苷含量為1.141%，微波提取蕓香苷含量為1.193%。微波提取效果優(yōu)于超聲提取，差異顯著（p＜0.05）。