綿羊SMAD1基因組織表達(dá)及其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

田志龍，湯繼順，孫慶，王玉琴，張效生，張金龍，儲明星

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綿羊SMAD1基因組織表達(dá)及其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

田志龍1,2，湯繼順1，孫慶1，王玉琴2，張效生3，張金龍3，儲明星1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003；3天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

【目的】綿羊產(chǎn)羔數(shù)是一個極其復(fù)雜的性狀，受諸多因素影響。綿羊排卵數(shù)是最重要的因素之一，而SMAD蛋白在哺乳動物卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞生長分化過程中發(fā)揮著重要作用。因此本文基于前期綿羊基因組重測序數(shù)據(jù)，深入研究SMAD家族成員1 (SMAD family member 1, SMAD1)基因在不同繁殖力小尾寒羊組織表達(dá)模式，并探討其多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，以揭示其影響產(chǎn)羔數(shù)的機(jī)制，為綿羊分子育種提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā渴紫?，采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群體大腦，小腦，下丘腦，垂體，子宮，卵巢，輸卵管，心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟，腎上腺，甲狀腺，大腸，小腸，胰腺，瘤胃，腎脂 19種組織的表達(dá)模式，然后利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘腦，垂體，子宮，卵巢，輸卵管5種繁殖組織的相對表達(dá)量。隨后采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)對SMAD1基因5個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)在小尾寒羊（n=380）、湖羊（n=101）、蘇尼特羊（n=21）、草原型藏羊（n=161）、策勒黑羊（n=52）、灘羊（n=22）6個綿羊品種中進(jìn)行基因型檢測，計算其群體遺傳學(xué)指標(biāo)，利用SPSS19.0軟件分析5個SNPs與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】PCR結(jié)果顯示，SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊全身性組織均有表達(dá)，在小尾寒羊單羔群體卵巢的表達(dá)量極顯著高于多羔群體（＜0.01），小尾寒羊單羔群體下丘腦、垂體的表達(dá)量顯著高于多羔群體（＜0.05）；基因分型結(jié)果表明，g.12485895A＞G，g.12487558G＞A和g.12487190G＞T位點(diǎn)在單、多羔綿羊品種中基因型和等位基因頻率均差異顯著（＜0.05）；而g.12508874T＞C和g.12487467A＞G位點(diǎn)在單、多羔綿羊品種中基因型和等位基因頻率均差異不顯著（＞0.05）；群體遺傳學(xué)分析表明，g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12508874T＞C、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T位點(diǎn)在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、蘇尼特羊、草原型藏羊中均為中度多態(tài)（0.25＜＜0.5），g.12508874T＞C位點(diǎn)在灘羊群體表現(xiàn)為低度多態(tài)（＜0.25）；卡方適合性檢驗(yàn)表明，g.12485895A＞G和g.12487467A＞G位點(diǎn)在小尾寒羊和草原型藏羊中處在Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（＜0.05），g.12487558G＞A在小尾寒羊和湖羊群體處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（＜0.05），g.12487190G＞T位點(diǎn)在草原型藏羊處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（＜0.05）。其他位點(diǎn)在6個綿羊品種中均處在Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（＞0.05）；關(guān)聯(lián)分析表明，g.12485895A＞G，g.12487558G＞A，g.12508874T＞C和g.12487467A＞G位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián)。g.12487190G＞T位點(diǎn)TT基因型母羊前三胎的產(chǎn)羔數(shù)均顯著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。將該位點(diǎn)與小尾寒羊（A746G）不同基因型進(jìn)行組合后發(fā)現(xiàn)，AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著低于其他組合基因型母羊（＜0.05）。【結(jié)論】與小尾寒羊繁殖密切相關(guān)，g.12487190G＞T可作為小尾寒羊產(chǎn)羔性狀選育的潛在分子標(biāo)記。

綿羊；SMAD1基因；組織表達(dá)；SNP分型；產(chǎn)羔數(shù)

0 引言

【研究意義】綿羊產(chǎn)羔數(shù)是一個極其復(fù)雜的性狀，受諸多因素影響。大多數(shù)綿羊都是季節(jié)性發(fā)情、單羔品種，且綿羊產(chǎn)羔性狀的遺傳力較低，僅為0.1左右，常規(guī)育種技術(shù)在短期內(nèi)很難改良產(chǎn)羔性狀。因此，闡明綿羊高繁殖力形成的分子機(jī)理，為分子標(biāo)記輔助選擇提供有效位點(diǎn)，就變得尤為重要。【前人研究進(jìn)展】在哺乳動物卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞生長分化過程中，需要促性腺激素、性腺類固醇激素和細(xì)胞因子等共同調(diào)控，其中細(xì)胞因子以旁分泌和自分泌方式在生殖細(xì)胞間進(jìn)行信號對話，實(shí)現(xiàn)對卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞生長分化的調(diào)控作用，主要包括Wnt/β-catenin[1-2]、MAPK[3]和TGF-β/Smad[4]信號通路等。SMAD蛋白是TGF-β/SMADs信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞外TGF-β信號在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。研究表明，TGF-β/SMADs信號通路在哺乳動物卵巢卵泡的發(fā)育，卵泡的閉鎖與選擇過程中發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用[7]。SMAD1作為TGF-β/SMADs信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于不同的組織并介導(dǎo)多種類型的生理過程[8]。綿羊FecB基因是學(xué)術(shù)界公認(rèn)影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，F(xiàn)ecB基因?qū)儆赥GF-β/SMADs信號通路。一個FecB基因拷貝可以增加排卵數(shù)1.3—1.6枚，兩個FecB基因拷貝可以增加排卵數(shù)2.73枚；攜帶一個FecB基因拷貝的母羊產(chǎn)羔數(shù)增加0.9—1.2只，攜帶兩個FecB基因拷貝的母羊產(chǎn)羔數(shù)增加1.1—1.7只[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國內(nèi)外對TGF-β/SMADs信號通路相關(guān)基因的研究較多，但對SMAD1基因在綿羊中的表達(dá)及其多態(tài)性的研究并不多見。并且在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊群體中FecB基因野生型個體存在產(chǎn)多羔的現(xiàn)象?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過使用Taqman探針法對小尾寒羊進(jìn)行分型，選擇FecB基因突變野生型小尾寒羊，連續(xù)觀察黃體數(shù)并記錄產(chǎn)羔數(shù)（產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)均大于或等于2，則定義為多羔）。獲得小尾寒羊FecB基因突變野生型單羔群體和多羔群體（下文簡稱單羔、多羔），以此為研究對象，采用反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群體中的表達(dá)差異，期望從轉(zhuǎn)錄水平初步揭示SMAD1基因在綿羊多羔繁殖中的作用，同時對小尾寒羊、湖羊、蘇尼特羊、灘羊、策勒黑羊、草原型藏羊等6個綿羊品種的SMAD1基因g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12508874T＞C、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T等5個SNPs進(jìn)行研究，為綿羊標(biāo)記輔助選擇提供新的參考位點(diǎn)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年1—8月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 樣品采集和主要試劑

不同繁殖力小尾寒羊（基因野生型單羔和多羔）來自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場，從中挑選健康狀況良好成年母羊各3只，使用陰道孕酮栓（controlled internal drug release，CIDR）進(jìn)行同期發(fā)情處理，12d后撤栓。在撤栓后45 h屠宰并立即采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、甲狀腺、大腸、小腸、胰腺、瘤胃、腎脂19個組織，液氮中保存，直至提取RNA。

動物組織總RNA提取試劑盒（DP431）和血液基因組DNA提取系統(tǒng)（DP349）購自天根生化科技有限公司（北京），PCR Master Mix購于北京拓英坊科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）和熒光定量染料(RR820A)均購自大連寶生物公司，基因分型試劑和儀器均來自康普森生物技術(shù)有限公司（北京）。

1.2 組織總RNA/DNA的提取和檢測

采用動物組織總RNA提取試劑盒/血液基因組DNA提取系統(tǒng)（天根，北京）提取各組織總RNA/DNA，并用Nanodrop 2000檢測提取RNA/DNA的純度和濃度，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA/DNA完整性。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank提供的綿羊SMAD1基因mRNA序列（登錄號為：XM_012097420.2）利用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase ,）（XM_015089125.1）作為內(nèi)參基因。FecB基因分型引物及探針參考文獻(xiàn)[10]。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，具體信息見表1。

1.4 半定量RT-PCR反應(yīng)及熒光定量PCR

試驗(yàn)用cDNA合成及RT-PCR和熒光定量PCR試驗(yàn)過程如周梅[11]所述。簡言之，即按反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供步驟進(jìn)行cDNA的合成，使用2×PCR Master Mix對SMAD1基因進(jìn)行PCR，最后使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行熒光定量檢測。

1.5 實(shí)時熒光定量檢測及數(shù)據(jù)處理

熒光定量檢測利用Roche Light Cycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀進(jìn)行，以為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)檢測3次。采用2-ΔΔCT法[12]計算目的基因相對表達(dá)量，利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，使用鄧肯氏（Duncan’s）法進(jìn)行多重比較。

1.6 基因分型及數(shù)據(jù)處理

使用Taqman分型技術(shù)對有產(chǎn)羔記錄的380只小尾寒羊進(jìn)行FecB（A746G）基因型檢測，具體方法如劉秋月之前所述[10]。簡言之，以小尾寒羊DNA為模板，利用表1中所述引物和探針，進(jìn)行熒光定量PCR，檢測熒光值的變化并對綿羊FecB（A746G）基因型進(jìn)行判定。采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)[11-13]對SMAD1基因g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12508874T＞C、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測。分型樣品選擇：有產(chǎn)羔數(shù)記錄的小尾寒羊380只、湖羊101只、策勒黑羊52只、蘇尼特羊21只、灘羊22只、草原型藏羊161只。分型樣品為DNA，每個樣品需要量為20 μL，DNA濃度為40—80 ng·μL-1。

表1 綿羊SMAD1基因的引物信息

綿羊SMAD1基因5個SNPs位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析及其與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析如筆者之前所述[14]。將與小尾寒羊產(chǎn)羔產(chǎn)生顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，使用yijklmn=μ+Gi+Gj+Gi×Gj+Pl+Sm+eijklmn進(jìn)行多基因聚合分析。其中，yijklmn是性狀觀察值（產(chǎn)羔數(shù)）；μ為總體均值；Gi為i標(biāo)記基因主效應(yīng)；Gj為j標(biāo)記基因主效應(yīng)；Gi×Gj為i和j基因的互作效應(yīng)；Pl為胎次效應(yīng)；Sm為季節(jié)效應(yīng)；eijklmn為隨機(jī)殘差效應(yīng)。用SPSS19.0軟件程序中一般線性模型完成小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取與cDNA合成

提取不同繁殖力小尾寒羊各組織的總RNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。28S和18S條帶清晰可見，且灰度值約為2﹕1，而5S帶幾乎沒有，說明提取的總RNA無明顯降解（圖1），Nanodrop 2000檢測各組織RNA，A260/A280均在1.8—2.1之間，表明提取的RNA純度較高，可用于后續(xù)的熒光定量PCR反應(yīng)。以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對GAPDH基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示GAPDH基因在小尾寒羊不同組織擴(kuò)增效果良好，具有明顯內(nèi)參基因特征。

2.2 SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群體各組織中的表達(dá)分析

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，SMAD1基因在全身性組織均有表達(dá)，且在小尾寒羊單、多羔群體中表達(dá)量趨勢較為一致（圖2）。在小尾寒羊單羔群體下丘腦-垂體-卵巢軸組織的表達(dá)量略高于多羔群體。隨后使用實(shí)時熒光定量對小尾寒羊單、多羔群體5個繁殖相關(guān)組織SMAD1基因的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：SMAD1基因在小尾寒羊下丘腦-垂體-卵巢軸組織均有表達(dá)（圖3），在小尾寒羊單羔群體卵巢的表達(dá)量極顯著高于多羔群體（＜0.01），小尾寒羊單羔群體下丘腦、垂體的表達(dá)量顯著高于多羔群體（＜0.05），在其余組織則不存在顯著差異（＞0.05）。

M代表 DL2000 DNA Marker；1-7分別代表：大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管

2.3 SMAD1基因多態(tài)性分析

通過分型發(fā)現(xiàn)SMAD1基因5個SNPs在綿羊群體中均存在3種基因型，見圖4。由表2可知，除了g.12508874T＞C、g.12487467A＞G位點(diǎn)外，其余3個SNPs在單、多羔綿羊品種中基因型和等位基因頻率均差異顯著（＜0.05）。群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)（表3），SMAD1基因g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T位點(diǎn)在小尾寒羊、湖羊、草原型藏羊、策勒黑羊、蘇尼特羊、灘羊群體中均為中度多態(tài)（0.25＜＜0.5），g.12508874T＞C位點(diǎn)在灘羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（＜0.25），在其他綿羊群體為中度多態(tài)（0.25＜＜0.5）。g.12485895A＞G、g.12487467A＞G位點(diǎn)在小尾寒羊和草原型藏羊中表現(xiàn)為Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（＜0.05）；g.12487558G＞A位點(diǎn)在小尾寒羊和湖羊中表現(xiàn)為Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（＜0.05）；g.12487190G＞T位點(diǎn)在草原型藏羊中表現(xiàn)為Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（＜0.05），其余SNPs在不同綿羊品種中均表現(xiàn)為Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（＞0.05）。

M：DL2000 DNA Marker；1-19：大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、甲狀腺、大腸、小腸、胰腺、瘤胃、腎脂；253 bp和149 bp分別代表SMAD1和GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物大??；A代表單羔群體、B代表多羔群體

?*表示差異顯著(P＜0.05)；**表示差異極顯著（P＜0.01）

表2 SMAD1基因位點(diǎn)在單、多羔綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

表3 SMAD1基因不同位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

＞0.05表示位點(diǎn)在該品種中處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)

＞0.05 indicates the locus was in Hardy-Weinberg equilibrium

2.4 SMAD1基因多態(tài)性與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

由表4可知，SMAD1基因g.12487190G＞T位點(diǎn)多態(tài)性與小尾寒羊前三胎產(chǎn)羔數(shù)均顯著相關(guān)（＜0.05），TT基因型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。其他4個位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)之間無顯著關(guān)聯(lián)。將該位點(diǎn)與小尾寒羊（A746G）不同基因型進(jìn)行組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共存在9種不同組合基因型（表5），組合基因型與小尾寒羊第一胎、第二胎、第三胎產(chǎn)羔數(shù)均顯著關(guān)聯(lián)（＜0.05），其中AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著低于其他組合基因型母羊（＜0.05）。

圖4 SMAD1基因5個SNPs位點(diǎn)分型結(jié)果

表4 SMAD1基因SNPs位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

對于每一個位點(diǎn)同一列中標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

表5 SMAD1與FecB組合基因型與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

3 討論

3.1 SMAD1基因表達(dá)與動物繁殖的關(guān)系

研究表明，TGF-β/SMADs信號通路參與了胚胎早期發(fā)生、骨形成和組織修復(fù)等過程，在細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡以及免疫和內(nèi)分泌等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[15-16]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/SMADs信號通路在哺乳動物的卵泡發(fā)育、卵泡的選擇與閉鎖過程中發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用[17]。在這一過程中，該通路中的關(guān)鍵成員（配體、受體、信號分子等）在整個生殖系統(tǒng)中都有協(xié)調(diào)的時空表達(dá)模式、控制和調(diào)節(jié)卵巢的生理學(xué)功能[18]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，有絲分裂原活化蛋白激酶（Ras-MAPK）信號通路以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）通過改變類固醇合成酶基因表達(dá)來調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞類固醇的合成[3]。大量研究表明，顆粒細(xì)胞的發(fā)育與卵泡的發(fā)育成熟和排卵密切相關(guān)[19]，而顆粒細(xì)胞的發(fā)育過程又受到多種激素和激素受體的調(diào)節(jié)，這其中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體素（luteinizing hormone, LH）通過與其它細(xì)胞因子互作影響顆粒細(xì)胞增殖、分化以及卵泡成熟[20-21]。體外大鼠顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)表明BMP4和BMP7可以提高FSH依賴的E2分泌[22]，而BMP4、BMP6、BMP7和BMP15抑制FSH誘導(dǎo)的P4的分泌[23-25]。其他研究也表明，阻斷BMP/SMADs信號通路抑制了類固醇合成酶基因的表達(dá)[17]。據(jù)報道作為BMP/SMAD信號通路抑制劑，可以通過SMAD1/5/8通路顯著影響，和的功能表達(dá)，并導(dǎo)致綿羊排卵數(shù)增加[26]。因此，推測通過調(diào)節(jié)，和功能來控制綿羊排卵數(shù)進(jìn)而控制產(chǎn)羔數(shù)。目前，對SMAD1基因的研究多集中于小鼠，對小尾寒羊的研究相對較少。本研究中，RT-PCR和實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，SMAD1基因在全身性組織均有表達(dá)，且在小尾寒羊單、多羔群體中表達(dá)量趨勢較為一致。這和牛家強(qiáng)[27-28]等研究結(jié)果一致，同樣也與所有TGF-β超家族很多成員都需要通過SMAD1蛋白進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究結(jié)論一致。SMAD1基因在小尾寒羊單羔群體卵巢的表達(dá)量顯著高于多羔群體（＜0.01），小尾寒羊單羔群體下丘腦、垂體的表達(dá)量顯著高于多羔群體（＜0.05）。下丘腦-垂體-卵巢軸是控制哺乳動物性激素分泌的重要系統(tǒng)，與動物繁殖密切相關(guān)。SMAD1基因在此系統(tǒng)的差異表達(dá)，意味著該基因可能通過下丘腦-垂體-卵巢軸的負(fù)反饋途徑調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和排卵，進(jìn)而影響不同繁殖力小尾寒羊群體的繁殖性狀。但由于并未進(jìn)行SMAD1蛋白的定量研究，該結(jié)果仍需繼續(xù)研究。

3.2 SMAD1基因多態(tài)性與動物繁殖的關(guān)系

現(xiàn)階段關(guān)于SMAD1基因多態(tài)與動物繁殖的報道多集中于水生動物，在哺乳動物中的研究較少。池秋蝶等[29]通過外顯子測序獲得文蛤Smad1基因多態(tài)信息，并發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性可以影響文蛤的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)SMAD1基因g.12487190G＞T位點(diǎn)在小尾寒羊、湖羊、草原型藏羊、策勒黑羊、蘇尼特羊、灘羊群體中均為中度多態(tài)（0.25＜＜0.5），并且其多態(tài)性與小尾寒羊前三胎產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)（＜0.05）。對該位點(diǎn)進(jìn)行基因定位研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)處于SMAD1基因第5內(nèi)含子區(qū)域。雖然內(nèi)含子不編碼氨基酸，無法影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但其突變可能控制基因轉(zhuǎn)錄活性并影響SMAD1基因的表達(dá)。關(guān)于內(nèi)含子變異影響動物表型的報道很多。秦川牛SMAD3基因內(nèi)含子3（g.101664C＞G）和內(nèi)含子5（g.114523A＞G）變異顯著影響其體重、胸圍和臀部長度[30]（＜0.05）。皖江白鵝SMAD9基因內(nèi)含子2的C＞T變異，顯著影響其產(chǎn)蛋性能[31]。陜北白絨山羊[32]賴氨酸脫甲基酶6A（lysine demethylase 6A, KDM6A）基因第17內(nèi)含子的16個堿基的插入缺失導(dǎo)致其mRNA表達(dá)量的不同，最終顯著提高產(chǎn)羔數(shù)（＜0.05）。這些研究表明，內(nèi)含子變異不僅影響轉(zhuǎn)錄和剪接過程，還可以通過控制基因表達(dá)來調(diào)控動物表型。Xu等[33]研究發(fā)現(xiàn)位于SMAD1基因內(nèi)含子區(qū)域的rs40635766突變與湖羊繁殖力密切相關(guān)，可能是控制湖羊多羔繁殖的一個主效基因，這和本研究的結(jié)果一致。g.12485895A＞G、g.12487467A＞G、g.12487558G＞A、g.12487190G＞T位點(diǎn)在綿羊群體中存在不同程度的Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。可能是由于參與分型計算的樣本量不夠多或者綿羊群體存在人工選育造成的此類現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)g.12487190G＞T位點(diǎn)TT基因型小尾寒羊母羊前三胎的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。將該位點(diǎn)與小尾寒羊A746G）不同基因型進(jìn)行組合，發(fā)現(xiàn)AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著低于其他組合基因型母羊（＜0.05），而AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊產(chǎn)羔數(shù)不存在差異（＞0.05）。該結(jié)果暗示，SMAD1基因調(diào)控綿羊產(chǎn)羔性狀的機(jī)制與FecBA746G）基因密不可分。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，SMAD1基因在綿羊組織中呈全身性表達(dá)，在小尾寒羊單羔群體下丘腦、垂體、卵巢的表達(dá)量高于多羔群體（＜0.05）。g.12487190G＞T突變中TT基因型母羊產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。因此，SMAD1基因可能是影響小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的一個重要候選基因，且g.12487190G＞T位點(diǎn)對小尾寒羊多羔性狀選育具有一定的指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Tissue Expression and Polymorphism of Sheep SMAD1 Gene and Their Association with Litter Size

TIAN ZhiLong1,2, TANG JiShun1, SUN Qing1, WANG YuQin2, ZHANG XiaoSheng3, ZHANG JinLong3, CHU MingXing1

(1Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan;3Tianjin Institute of Animal Sciences, Tianjin 300381)

【Objective】Sheep litter size is a very complex trait influenced by many factors. Ovulation is one of the most important factors. SMAD protein plays an important role in the mammalian follicular development as well as growth and differentiation process of granulosa cell.To reveal the relationship between the SMAD family member 1 (SMAD1) gene and the litter size of sheep and its mechanism affecting litter size, meanwhile to provide a scientific basis for sheep molecular breeding, we researched the expression pattern of【Method】First, reverse transcription PCR was used to detect the expression of SMAD1 gene in Small Tail Han sheep (brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, uterus, ovary, oviduct, heart, liver, spleen, lung, kidney, adrenal glands, thyroid, large intestine, small intestine, pancreas, rumen, and kidney fat) tissues with different lambing abilities. Then, Real-time PCR was performed to investigate the expression of SMAD1 gene in Small Tail Han sheep reproduction tissues (hypothalamus, pituitary, uterus, ovary, and oviduct) with different lambing abilities. Multiparous (Small Tail Han sheep (n=380), Hu sheep (n=101), Cele black sheep (n=52)) and uniparous (Sunite (n=21), Tan sheep (n=22), Prairie Tibetan sheep (n=161)) sheep breeds were selected and Sequenom MassARRAY?SNP assay was applied to genotype five single nucleotide polymorphism sites (SNPs) of SMAD1 gene. Then the association was analyzed between SMAD1 and litter size in Small Tail Han sheep by using SPSS 19.0. 【Result】The results of RT-PCR revealed that SMAD1 gene expressed in 19 tissues. The qPCR showed that the expression ofwas higher in ovary (＜0.01), hypothalamus (＜0.05) and pituitary (＜0.05) of uniparous Small Tail Han sheep than that in multiparous sheep. From genotyping, this study found that the genotype frequencies and allele frequencies of the g.12485895A＞G, g.12487558G＞A and g.12487190G＞T of SMAD1 gene were significantly different between uniparous and multiparous sheep (＜0.05). However, g.12508874T＞C and g.12487467A＞G had no significantly different between uniparous and multiparous sheep (＞0.05). Population genetic analysis indicated that g.12485895A＞G, g.12487558G＞A, g.12508874T＞C, g.12487467A＞G, and g.12487190G＞T loci were at moderate polymorphism (0.25＜＜0.5) in Small Tail Han sheep, Hu sheep, Prairie Tibetan sheep, Cele black sheep, Sunite and Tan sheep, while g.12508874T＞C was at low polymorphism (＜0.25) in Tan sheep. The χ2test indicated that the g.12485895A＞G and g.12487467 A＞G were not under Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05) in Small Tail Han sheep and Prairie Tibetan sheep. g.12487558 G＞A was not under Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05) in Small Tail Han sheep and Hu sheep. g.12487190 G＞T was not under Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05) in Prairie Tibetan sheep. Other loci were under Hardy-Weinberg equilibrium (＞0.05) in six sheep breeds. Association analysis indicated that the polymorphism of g.12487190 G＞T had significant correlation with the litter size in Small Tail Han sheep, while the litter size of TT was higher than GT and GG in the first three births (＜0.05). However, the polymorphism of g.12485895A＞G, g.12487558G＞A, g.12508874T＞C and g.12487467A＞G had no significant correlation with the litter size in Small Tail Han sheep. The combination of SMAD1 gene g.12487190G＞T and(A746G) gene showed that the number of lambs in AA-GG, AA-GT, AA-TT genotypes was significantly low than that of other genotypes (＜0.05), respectively. 【Conclusion】Therefore, it could be concluded thatmight be the key gene for litter size and the g.12487190G＞T locus might provide a basis for litter size trait selection in sheep.

sheep; SMAD1gene; tissue expression; SNP genotyping; litter size

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.04.015

2018-09-03；

2018-12-29

國家自然科學(xué)基金（31772580）、國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-38）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS13）

田志龍，E-mail：tianzl0515@163.com。通信作者王玉琴，E-mail：wangyq6836@163.com；儲明星，E-mail：mxchu@263.net