轉(zhuǎn)錄組學(xué)在牧草上的應(yīng)用進(jìn)展

王 飛，劉林波，高天歌，高 鯉，包愛(ài)科，王鎖民

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020）

轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是在某一生理?xiàng)l件下，生物體細(xì)胞內(nèi)特定組織或器官轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA產(chǎn)物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA以及非編碼RNA[1-2]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)適用于在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及調(diào)控規(guī)律，包括非編碼區(qū)域功能研究、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究、基因轉(zhuǎn)錄水平研究和全新轉(zhuǎn)錄區(qū)域研究[3]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序即RNA測(cè)序(RNA-Seq)，指利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行cDNA測(cè)序(RNA-seq)[2]。相較于傳統(tǒng)的基因芯片測(cè)序[4]，RNA-Seq可全面并準(zhǔn)確地測(cè)定出多細(xì)胞生物整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，已被應(yīng)用于生物學(xué)研究及醫(yī)藥研究的多個(gè)領(lǐng)域。在植物方面，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在玉米(Zea mays)[5-8]、小麥(Triticum aestivum)[9-12]、水稻(Oryza sativa)[13-15]以及大豆(Glycine max)[16-18]等作物研究中已有廣泛的應(yīng)用。牧草是供牲畜飼用的草或其他草本植物，是畜牧業(yè)能夠快速穩(wěn)定發(fā)展的基礎(chǔ)。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、重要性狀形成機(jī)制以及優(yōu)異基因資源挖掘、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面已開(kāi)始應(yīng)用，并取得了一系列重要進(jìn)展。本研究從高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫適應(yīng)機(jī)制、非生物脅迫(鹽堿、極端溫度、干旱、營(yíng)養(yǎng)虧缺、重金屬等)適應(yīng)機(jī)理、逆境轉(zhuǎn)錄因子挖掘和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面對(duì)相關(guān)研究進(jìn)行綜述，以期為牧草種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用、優(yōu)異基因的挖掘和牧草分子育種提供一定的依據(jù)。

1 高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

高通量測(cè)序技術(shù)又稱深度測(cè)序(deep sequencing)技術(shù)，包括第二代測(cè)序技術(shù)(new sequencing technologies)[19]和單分子測(cè)序技術(shù)，可以同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，使得對(duì)一個(gè)物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組的全面分析成為可能，是測(cè)序技術(shù)發(fā)展史上的一個(gè)重要里程碑。

1.1 第二代測(cè)序技術(shù)

隨著人類基因組測(cè)序工程及模式生物基因組測(cè)序的完成，重測(cè)序技術(shù)開(kāi)始被應(yīng)用。傳統(tǒng)的測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，因此出現(xiàn)了費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測(cè)序技術(shù)，被稱為“第二代測(cè)序技術(shù)”。第二代測(cè)序技術(shù)包括Roche/454[20]、Illumina[21]、美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的SOLiD[22]與HelicosHeliScope[23]。四大測(cè)序平臺(tái)各有其優(yōu)缺點(diǎn)：Roche/454的測(cè)序原理為焦磷酸合成測(cè)序，平均讀長(zhǎng) 400 bp，數(shù)據(jù)量 0.5 Gb·run-1，準(zhǔn)確率 ≥ 99%，讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，運(yùn)行速度快，但試劑花費(fèi)高且同源重復(fù)序列出錯(cuò)率較高[24-26]；Illumina的測(cè)序原理為可逆染料終結(jié)合成測(cè)序，平均讀長(zhǎng)100 bp，數(shù)據(jù)量54～60 Gb·run-1，準(zhǔn)確率 98%～99%，性價(jià)比高，是目前應(yīng)用最廣泛的平臺(tái)，但讀長(zhǎng)短[25-27]；SOLiD的測(cè)序原理為連接測(cè)序，平均讀長(zhǎng)50 bp，數(shù)據(jù)量100 Gb·run-1，準(zhǔn)確率 ≥ 99.94%，準(zhǔn)確率最高但是讀長(zhǎng)短 、 運(yùn) 行 時(shí) 間 長(zhǎng)[25-26, 28]； Helicos HeliScope 的 測(cè) 序原理為單分子合成測(cè)序，平均讀長(zhǎng)35 bp，數(shù)據(jù)量21～35 Gb·run-1，準(zhǔn)確率 97%～99.8%，產(chǎn)量高、文庫(kù)制備簡(jiǎn)單，不需要DNA擴(kuò)增或連接，但失誤率高[25-26, 29]。二代測(cè)序技術(shù)的到來(lái)極大地減少了測(cè)序成本、降低了試驗(yàn)的復(fù)雜性，同時(shí)提高了轉(zhuǎn)錄本的覆蓋度，使得基于轉(zhuǎn)錄組分析測(cè)序在科學(xué)研究中更加可行和有用，其已被廣泛應(yīng)用于新基因的發(fā)掘、標(biāo)記基因的開(kāi)發(fā)、轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制和生物代謝途徑的確定等諸多領(lǐng)域。

1.2 單分子測(cè)序技術(shù)

雖然第二代測(cè)序技術(shù)已被應(yīng)用到科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域，但也存在著許多的不足。如，測(cè)序讀長(zhǎng)較短[30]，擴(kuò)增后得到的DNA分子片段的數(shù)目與擴(kuò)增前相比有相對(duì)偏差[31]，這些缺點(diǎn)在一定程度上限制了第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，出現(xiàn)了第三代測(cè)序技術(shù)。第三代測(cè)序技術(shù)即單分子測(cè)序技術(shù)，采用分子讀取技術(shù)，讀取數(shù)據(jù)速度更快的同時(shí)不需要PCR擴(kuò)增步驟，從而降低了測(cè)序的成本，其測(cè)序平臺(tái)主要有Helicos biosciences 公司的 tSMSTM(true single molecular sequencing)技術(shù)平臺(tái)、美國(guó) Pacific Biosciences 公司的 SMRT(single molecule real-time)技術(shù)平臺(tái)、美國(guó)Life Technologies 公司的基于 FRET 測(cè)序技術(shù)以及美國(guó) Ion Torrent 公司與英國(guó) Oxford NanoporeNechnologies公司的納米孔單分子技術(shù)[32-33]。由于第三代測(cè)序技術(shù)相比于第二代測(cè)序技術(shù)具有更高的通量、相對(duì)便宜的測(cè)序儀器和試劑以及更加簡(jiǎn)單的操作，已被應(yīng)用于基因組測(cè)序、突變鑒定、RNA測(cè)序、重復(fù)序列和PolyA結(jié)構(gòu)的測(cè)序及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草生長(zhǎng)發(fā)育研究中的應(yīng)用

植物的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，在各種物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)上表現(xiàn)為種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)以及植物體的死亡。對(duì)牧草而言，牧草產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與植物的生長(zhǎng)發(fā)育是密不可分的。要獲得高產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的牧草，最有效的途徑之一就是從牧草的生長(zhǎng)發(fā)育研究入手，挖掘它們自身中與各種代謝途徑密切相關(guān)的基因，并利用這些基因?qū)δ敛葸M(jìn)行遺傳改良。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。

Zhang等[34-35]測(cè)定了兩個(gè)不同品種(休眠和非休眠性)紫花苜蓿(Medicago sativa)在不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組，分析得到了與紫花苜蓿秋眠性相關(guān)的一些基因，為解析苜蓿的秋眠性機(jī)理提供了一定的參考。Martin等[36-37]對(duì)C4模式植物狗尾草(Setaria viridis)分生組織、細(xì)胞過(guò)渡、擴(kuò)張和成熟區(qū)分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，得到了其完整的基因表達(dá)和代謝產(chǎn)物圖譜，同時(shí)他們還通過(guò)對(duì)狗尾草莖節(jié)間的RNA-seq測(cè)序分析，為探究狗尾草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中莖節(jié)間細(xì)胞壁沉積的基本生理與分子機(jī)制提供了依據(jù)。張曼[38]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)測(cè)定了在超高濃度CO2中生長(zhǎng)的狗尾草葉片，并同正常條件下生長(zhǎng)的狗尾草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，篩選得到了參與糖代謝、光合作用、氧化還原反應(yīng)和脅迫刺激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程的174個(gè)差異基因，此結(jié)果為解讀C4植物響應(yīng)超高濃度CO2的分子機(jī)制提供了幫助。這些研究有助于從分子水平上對(duì)牧草的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行認(rèn)識(shí)，并可通過(guò)這些差異基因?qū)δ敛葸M(jìn)行遺傳改良。

3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在牧草抗逆機(jī)制研究中的應(yīng)用

環(huán)境因子和病蟲(chóng)害等嚴(yán)重影響牧草的正常生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。研究植物抗逆機(jī)制并利用基因工程的方法培育抗逆植株具有重要意義。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草抗逆機(jī)制研究中已得到了廣泛的應(yīng)用(表1)，以下將對(duì)相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

表1 已應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究抗逆機(jī)制的牧草種類Table 1 Species of forage that have studied the mechanism of stress resistance by transcriptome sequencing

3.1 牧草對(duì)生物脅迫的適應(yīng)機(jī)制

與其他植物一樣，牧草遭受到病原微生物的侵害后會(huì)發(fā)生新陳代謝紊亂，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量與品質(zhì)。當(dāng)前，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，從牧草轉(zhuǎn)錄組中篩選與抗病原微生物侵入相關(guān)的基因并利用分子生物技術(shù)進(jìn)行遺傳控制，已成為防治牧草病害的有效途徑之一。Wichmann等[39]對(duì)被半透明黃單胞菌(Xanthomonas translucens)侵染的抗細(xì)菌性枯萎病(bacterial wilt)和易感病的兩種意大利黑麥草(Lolium perenne)在不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)被病菌侵染后，抗病型意大利黑麥草中有一些基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，說(shuō)明它們可能與意大利黑麥草抗細(xì)菌性枯萎病有關(guān)，此研究結(jié)果有助于黑麥草分子標(biāo)記輔助抗病育種相關(guān)工具的開(kāi)發(fā)與利用。褐斑病(brown spot)是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起的一種真菌病害，Zhu等[40]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析研究了立枯絲核菌AG1侵染結(jié)縷草(Zoysia japonica)栽培種“Zenith”根部后兩者之間存在的早期相互作用，揭示了立枯絲核菌與結(jié)縷草在侵染初期兩者相互作用過(guò)程中的表達(dá)譜，此研究對(duì)立枯絲核菌AG1-IA 關(guān)鍵致病性的鑒別起到了很大的幫助。

過(guò)度放牧導(dǎo)致牧草產(chǎn)量下降甚至植物死亡，易引起草原植被破壞和沙漠化，嚴(yán)重阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展。如何提高牧草的耐牧能力，最大限度的提高牧草效益，是畜牧業(yè)亟待解決的問(wèn)題之一。Liu等[41]利用RNA-seq測(cè)序技術(shù)分別測(cè)定了用牛唾液處理4、8和24 h后紫花苜蓿葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共得到4 814個(gè)差異表達(dá)基因，通過(guò)聚類、GO以及KEGG富集鑒定并分析這些基因發(fā)現(xiàn)它們?cè)陧憫?yīng)唾液沉積中起到了潛在的作用，并且這些基因的表達(dá)量在“亞油酸代謝”、“植物-病原體相互作用”、“a-亞麻酸代謝”、“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”和“核糖體”通路中都有明顯的增加，此研究不僅可以加深對(duì)苜蓿與唾液沉積之間復(fù)雜相互作用的理解，而且還將有助于了解植物對(duì)草食動(dòng)物放牧的響應(yīng)機(jī)制，以及利用育種手段對(duì)牧草進(jìn)行遺傳改良提供了潛在的目標(biāo)。石紅霄[42]采用HiSeqTM 2500高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)高原早熟禾(Poa alpigena)矮化和正常植株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選得到了在放牧條件下的高原早熟禾體內(nèi)與光合作用途徑、葉綠體光合代謝途徑、氧化磷酸化途徑、蛋白酶、過(guò)氧化物酶、脂肪降解以及Notch 信號(hào)途徑等富集差異通路相關(guān)的差異基因，并且發(fā)現(xiàn)這些功能差異基因與高原早熟禾適應(yīng)放牧脅迫的能力密切相關(guān)。這為利用分子手段改善牧草的耐放牧能力提供了一定的借鑒。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草抗病性和耐牧性上已有應(yīng)用，但在抗蟲(chóng)害和鼠害等方面應(yīng)用甚少。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出一些與牧草抗病蟲(chóng)害等生物脅迫相關(guān)的基因，并利用分子手段通過(guò)這些關(guān)鍵基因?qū)χ参镞M(jìn)行遺傳改良，是提高牧草產(chǎn)量和品質(zhì)的有效途徑之一。

3.2 牧草對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)機(jī)理

各種非生物脅迫因子影響牧草的正常生長(zhǎng)，造成草產(chǎn)量下降、牧草品質(zhì)降低，甚至植物的死亡。目前，高通量測(cè)序技術(shù)在研究牧草適應(yīng)非生物脅迫上已得到了廣泛的應(yīng)用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，可篩選得到與植物適應(yīng)非生物脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因，并利用其對(duì)抗性差的品質(zhì)進(jìn)行遺傳改良，從而有效提高牧草適應(yīng)非生物脅迫的能力。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草適應(yīng)非生物脅迫方面的研究主要集中在植物耐鹽堿、耐極端溫度、抗旱、營(yíng)養(yǎng)元素虧缺及重金屬毒害抗性等方面。

3.2.1 抗鹽堿機(jī)制

鹽堿會(huì)影響牧草苗期及生長(zhǎng)期的正常生長(zhǎng)發(fā)育，造成植物體內(nèi)養(yǎng)分吸收、利用和分配的不平衡，并產(chǎn)生離子毒害作用[43]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可為耐鹽堿牧草品種的選育與生產(chǎn)提供一定的科學(xué)依據(jù)，尤其在紫花苜蓿耐鹽堿機(jī)制的研究上應(yīng)用最為廣泛。An等[44]利用離子激流測(cè)序技術(shù)分別分析了在鹽堿溶液中生長(zhǎng)0、1和7 d后的紫花苜蓿幼苗的整株轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)在處理1和7 d后分別有2 286和 2 233個(gè)差異表達(dá)基因，有109和 96個(gè)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了顯著地變化，同時(shí)通過(guò)測(cè)定生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)活性氧清除系統(tǒng)、丙二醛和葉綠素含量等都發(fā)生了明顯的改變，此研究為探究紫花苜蓿適應(yīng)鹽堿脅迫的生理與分子機(jī)制提供了新的思路。Gruber等[45]通過(guò)分析和比較兩種新型耐鹽性南美紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇出更為耐鹽的新品種；陳冉冉等[46]通過(guò)大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到一個(gè)在堿脅迫下上調(diào)表達(dá)的假定蛋白基因GsARHP(alkali stress related hypothetical protein gene)，并證明了GsARHP基因的超量表達(dá)可以增強(qiáng)紫花苜蓿的耐堿能力；馬進(jìn)等[47]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿根系對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是多基因參與、多個(gè)生物代謝過(guò)程反應(yīng)協(xié)同調(diào)控的過(guò)程，基因表達(dá)量的變化可能是調(diào)控的主要方式；張婧蕾等[48]以南方型紫花苜蓿耐鹽突變體為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析同樣鑒定出了苜蓿中與鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)的差異表達(dá)基因。

除了紫花苜蓿，轉(zhuǎn)錄組學(xué)還應(yīng)用于霸王(Zygophyllum xanthoxylum)、羊草 (Leymu schinensis)以及鷹嘴豆(Cicer arietinum)等其他草類植物對(duì)鹽堿脅迫響應(yīng)的研究中。Ma 等[49]首次對(duì) 50 mmol·L-1NaCl脅迫處理下的多漿旱生植物霸王進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共得到106 423條Unigenes序列，通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜分析表明在鹽和滲透脅迫下，霸王的根、葉中與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、光合作用途徑以及活性氧清除系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)豐度都有明顯的上調(diào)，并鑒定出了霸王響應(yīng)鹽脅迫的關(guān)鍵基因，為干旱地區(qū)重要栽培牧草和作物品種抗逆性的遺傳改良提供了豐富的遺傳資源。Sun等[50]分別構(gòu)建了在空白 對(duì) 照 以 及 100 mmol·L-1NaCl與 200 mmol·L-1NaHCO3處理下羊草的cDNA文庫(kù)，利用Roche-454對(duì)這兩個(gè)不同的cDNA文庫(kù)進(jìn)行了大規(guī)模焦磷酸合成測(cè)序和分析，得到了同對(duì)照相比在鹽堿處理下的36 497個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和18 218個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，通過(guò)基因注釋和通道富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要與羊草脅迫響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換以及無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。Molina等[51]利用深度 SAGE 測(cè)定了在 25 mmol·L-1NaCl處理下鷹嘴豆的轉(zhuǎn)錄組，分析篩選得到了同活性氧清除系統(tǒng)以及Na+平衡相關(guān)的差異表達(dá)基因，為耐鹽品種的培育提供了一定的依據(jù)。

3.2.2 對(duì)極端溫度的適應(yīng)機(jī)理

極端溫度脅迫包括低溫脅迫與高溫脅迫，是危害牧草的主要環(huán)境脅迫之一，嚴(yán)重?fù)p害了牧草的生長(zhǎng)和生產(chǎn)潛能。目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)在這方面的研究主要集中在牧草適應(yīng)低溫脅迫及冷馴化上，在其適應(yīng)高溫脅迫方面的研究較少。張美萍等[52]通過(guò)對(duì)l6個(gè)紫花苜蓿中逆境應(yīng)答Ca2+-ATPase家族的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)紫花苜蓿Ca2+-ATPase家族基因受低溫和冷凍脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，為揭示苜蓿在低溫冷害應(yīng)答中的功能提供了重要的參考。顏朗等[53]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析揭示了皇竹草(Pennisetum sinese)的抗凍特性，對(duì)熱帶引種植物分子育種的開(kāi)展提供了參考；付娟娟[54]采用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)，探究了西藏野生垂穗披堿草(Elymus nutans)在低溫脅迫下的基因表達(dá)響應(yīng)，揭示了其適應(yīng)低溫的分子機(jī)制；Abeynayake等[55]在對(duì)適應(yīng)不同氣候類型的兩種不同基因型多年生黑麥草(Lolium perenne)進(jìn)行低溫馴化17 d后，分離出這兩種多年生黑麥草在不同時(shí)間點(diǎn)的總RNA，通過(guò)Illumina測(cè)序并分析，結(jié)果表明在低溫馴化中，這兩種不同基因型的多年生黑麥草響應(yīng)低溫脅迫的晝夜節(jié)律網(wǎng)受到了干擾，揭示了多年生黑麥草在低溫馴化中的分子機(jī)制。曹路等[56]利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)多年連續(xù)模擬增溫處理的荒漠草原區(qū)短花針茅(Stipa breviflora)在果后營(yíng)養(yǎng)期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析得到了 131 779 個(gè) hranscript和 54 075條 Unigenes，并將 1 791個(gè) DEGs在 151個(gè)代謝通路中進(jìn)行了注釋，此研究為保護(hù)野生飼草的種質(zhì)資源提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

3.2.3 抗旱機(jī)制

干旱也是影響牧草生產(chǎn)力的主要環(huán)境因素之一，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探究牧草適應(yīng)干旱脅迫機(jī)制的報(bào)道不是很多。冷暖等[57]采用高通量Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)在對(duì)照和干旱處理下的草地早熟禾(Poa pratensis)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析，共檢測(cè)得到24 465個(gè)差異表達(dá)基因，其中有4 143個(gè)上調(diào)基因和4 415個(gè)下調(diào)基因，通過(guò)富集分析發(fā)現(xiàn)了與蛋白激酶、蛋白磷酸酶、碳代謝以及ABA等草地早熟禾干旱響應(yīng)機(jī)制相關(guān)的基因，此研究為揭示草地早熟禾應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Ma等[49]通過(guò)對(duì)-0.5 MPa滲透脅迫處理下的霸王進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定出了霸王響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵基因，為干旱地區(qū)重要牧草和作物品種抗逆性的遺傳改良提供了豐富的遺傳資源。

3.2.4 對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)虧缺和重金屬脅迫的適應(yīng)機(jī)制

Byrne等[58]利用微陣列(microarray)測(cè)序技術(shù)研究了在缺磷(P)條件下生長(zhǎng)的多年生黑麥草中基因的表達(dá)情況，并進(jìn)行了氣相色譜-質(zhì)譜代謝圖譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在磷缺乏24 h后，多年生黑麥草的代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)錄本都發(fā)生了明顯的變化，表明了多年生黑麥草主要是通過(guò)磷脂的替代和糖酵解旁路來(lái)響應(yīng)缺磷脅迫的。丁氏清茶[59]測(cè)定分析了在鎘(Cd)處理下的甜高粱(Sorghum bicolor)轉(zhuǎn)錄組，分別在甜高粱莖和葉中得到了668和286個(gè)差異表達(dá)基因，并且通過(guò)檢測(cè)得到了35個(gè)與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及解毒相關(guān)的顯著表達(dá)基因，此研究為進(jìn)一步研究植物在鎘污染土壤中自身修復(fù)的基因網(wǎng)提供了參考。Montero-Palmero 等[60]將在3 μmol·L-1汞(Hg)處理3、6和24 h后紫花苜蓿根全基因組轉(zhuǎn)錄譜同蒺藜苜蓿(M. tructunla)微陣列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)在紫花苜蓿根中有559個(gè)差異表達(dá)基因且有91%的基因表達(dá)上調(diào)，而且大部分基因在汞處理3和6 h后都有所表達(dá)，它們主要同植物脅迫響應(yīng)、次級(jí)代謝和激素代謝有關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)乙烯參與了苜蓿對(duì)汞脅迫的早期響應(yīng)，調(diào)節(jié)了根系生長(zhǎng)抑制、NADPH-氧化酶活性和汞誘導(dǎo)的H2O2積累。Liu等[61]利用Illumina測(cè)序分析了在鋁(Al)脅迫4、8和24 h后紫花苜蓿根中轉(zhuǎn)錄組的變化情況，共得到2 464個(gè)差異表達(dá)基因，而且大多數(shù)都是在脅迫早期(4 h)和晚期(24 h)時(shí)表達(dá)上調(diào)，通過(guò)代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因參與了核糖體和蛋白質(zhì)的生物合成與加工、檸檬酸循環(huán)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及激素調(diào)節(jié)，說(shuō)明紫花苜蓿體內(nèi)解毒機(jī)制在鋁脅迫中發(fā)揮了重要的作用，此結(jié)果有助于了解苜蓿響應(yīng)鋁脅迫的分子機(jī)制。

這些研究有助于對(duì)牧草響應(yīng)礦質(zhì)元素缺乏和金屬離子脅迫的分子機(jī)制的了解，并為在重金屬污染地區(qū)植物適應(yīng)性改良提供新的思路。

4 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

4.1 SSR分子標(biāo)記

隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記作為一種全新的鑒定方法，由于其簡(jiǎn)單高效、成本低且重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被普遍應(yīng)用于物種和品種的鑒定，其中簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSRs)分子標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛。SSR標(biāo)記，又稱為微衛(wèi)星 DNA (microsatellite DNA)標(biāo)記，是一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)。SSR大量存在于真核基因組中，其多態(tài)性高、技術(shù)重復(fù)性好、易于操作。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，植物表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags, ESTs)已 經(jīng) 成 為 了 開(kāi) 發(fā)SSR分子標(biāo)記的重要資源，EST-SSR標(biāo)記廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種、品種鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)和DNA 指紋圖譜建立等方面[62-63]。牧草中的EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)已得到了越來(lái)越多的研究者的關(guān)注，截至目前已有多種物種通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了ESTSSR分子標(biāo)記，如紫花苜蓿、老芒麥(Elymus sibiricus)、狗尾草、羊草、箭筈豌豆(Vicia sativa)以及無(wú)芒隱子草(Cleistogenes songorica)。

陳天龍[64]利用紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果開(kāi)發(fā)了107對(duì)EST-SSR引物，為苜蓿育種研究的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。Liu等[65]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在紫花苜蓿中也開(kāi)發(fā)出了EST-SSR標(biāo)記，促進(jìn)了與苜蓿有關(guān)的遺傳和分子育種研究的發(fā)展。Zhou等[66]利用IlluminaHisSeq 2 000測(cè)序平臺(tái)對(duì)老芒麥愈傷組織、幼根和幼苗等11個(gè)不同組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果開(kāi)發(fā)了112個(gè)具有多態(tài)性的ESTSSR分子標(biāo)記，并揭示了這112對(duì)引物在E. abolinii和E. antiquus等13個(gè)披堿草屬物種中的通用性，推動(dòng)了老芒麥以及披堿草屬植物的遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種。Xu等[67]利用第二代測(cè)序技術(shù)測(cè)定分析了狗尾草不同發(fā)育時(shí)期不同組織和器官的轉(zhuǎn)錄組，以狗尾草基因組42 754個(gè)轉(zhuǎn)錄本為參考，組裝后共得到60 751個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別在參考組和轉(zhuǎn)錄組中鑒定出了9 576和 7 056個(gè)SSR標(biāo)記，這些SSRs標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)為狗尾草的遺傳學(xué)研究提供了一定的幫助。Chen等[68]從羊草轉(zhuǎn)錄組87 214 個(gè) Unigenes中鑒定出了 3 818 個(gè) EST-SSR 標(biāo)記，并分析了這些SSRs的核苷酸重復(fù)序列和主要顯性序列，發(fā)現(xiàn)三核苷酸序列在羊草SSRs中比例最高(74.12%)，且CCG序列在三核苷酸序列中占主導(dǎo)地位，其次是AGG和AGC，二核苷酸序列主要為AG和AC，這與在小麥和大麥(Hordeum vulgare)中的結(jié)果類似。他們還發(fā)現(xiàn)了109個(gè)包含ESTSSR且與冷響應(yīng)相關(guān)的Unigenes，它們主要編碼轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等調(diào)節(jié)蛋白。此研究結(jié)果豐富了羊草的轉(zhuǎn)錄組，為其分子育種提供了寶貴的資源。Liu等[69]從箭筈豌豆轉(zhuǎn)錄組中超過(guò)1 000 bp長(zhǎng)度的1 025個(gè) Unigenes中鑒定得到了1 071個(gè)潛在的EST-SSR標(biāo)記，并設(shè)計(jì)合成了450對(duì)引物，最終對(duì)10個(gè)箭筈豌豆種質(zhì)開(kāi)發(fā)了95對(duì)多態(tài)性引物，其中包括50個(gè)獨(dú)立引物。這95個(gè)EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)促進(jìn)了箭筈豌豆遺傳和分子育種的研究。Zhang等[70]構(gòu)建了在干旱脅迫下無(wú)芒隱子草葉和根的cDNA文庫(kù)，對(duì)5 664個(gè)隨機(jī)cDNA克隆進(jìn)行表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測(cè)序后共得到3 579個(gè)高質(zhì)量的修剪序列，修剪后的ESTs平均長(zhǎng)度為613 bp，并且在這些ESTs中發(fā)現(xiàn)了161個(gè)SSR。該研究中構(gòu)建的cDNA文庫(kù)和得到的ESTs有助于了解無(wú)芒隱子草抗旱性的潛在分子機(jī)制(表2)。

表2 應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了分子標(biāo)記的牧草種類Table 2 Species of forage that have developed the molecular marker by transcriptome sequencing

4.2 SNP分子標(biāo)記

SNP (single nucleotide polymorphism)標(biāo) 記 ， 即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，指在基因組上由單個(gè)核苷酸的變異形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富，是目前遺傳標(biāo)記中研究最多和最有前景的分子標(biāo)記。Lander[75-76]在1996年正式指出SNP開(kāi)啟了分子標(biāo)記新時(shí)代，該分子標(biāo)記是在以SSR和ISSR為代表的第二代分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第三代分子標(biāo)記技術(shù)。SNP標(biāo)記作為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記，適合于數(shù)量龐大的檢測(cè)分析，已被廣泛應(yīng)用于生物、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物進(jìn)化等眾多領(lǐng)域[77]。同EST-SSR相比，SNP標(biāo)記在牧草中的研究不是很多。Li等[71]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究了27種不同基因型苜蓿中的SNPs，發(fā)現(xiàn)在優(yōu)良紫花苜蓿繁殖種群中存在大量的單個(gè)SNPs標(biāo)記，而在未改良的紫花苜蓿種質(zhì)中SNP的多樣性明顯較低。Yang等[72]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)SNP和候補(bǔ)基因的鑒定有利于紫花苜蓿在飼料與纖維素方面的改良。Studer等[73]利用二代測(cè)序技術(shù)鑒定了多年生黑麥草中的SNPs，該研究是多年生黑麥草SNP標(biāo)記基因的發(fā)現(xiàn)和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄序列遺傳確立的重要里程碑，并為其遺傳育種提供了一種新的策略。Huang 等[74]通過(guò) IlluminaHiSeq 2 000 測(cè)序平臺(tái)測(cè)定了兩種不同基因型的鴨茅(耐熱型和熱感型)轉(zhuǎn)錄組，并從中鑒定得到了基因相關(guān)分子標(biāo)記包括SSRs和SNPs以及熱應(yīng)激差異表達(dá)基因，此研究說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)镾NPs和SSRs開(kāi)發(fā)和利用提供了有用的分子信息。

5 展望

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是分析基因表達(dá)差異、基因結(jié)構(gòu)變異、篩選分子標(biāo)記、完善和優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)、鑒定可變剪接體以及RNA編輯的重要手段。相較于傳統(tǒng)芯片，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不需要預(yù)先設(shè)計(jì)探針便可對(duì)任意物種的任意組織和細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，可以提供更準(zhǔn)確的數(shù)字化信息、更高的檢測(cè)通量和更廣泛的檢測(cè)范圍，已廣泛應(yīng)用于代謝工程、醫(yī)藥和植物細(xì)胞特性改造等諸多領(lǐng)域。

目前，第二代測(cè)序在牧草生長(zhǎng)發(fā)育、抗生物脅迫和非生物脅迫機(jī)制研究、優(yōu)異基因資源的挖掘以及分子標(biāo)記方面已得到了較為廣泛的應(yīng)用，為優(yōu)良牧草新品種的培育提供了理論指導(dǎo)。但當(dāng)前已完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的牧草種類仍然較少，而且在牧草品質(zhì)性狀、基因優(yōu)化及利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行ILP分子標(biāo)記以及LTR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)等方面的研究甚少。為了達(dá)到更高的測(cè)序精確度、更大的測(cè)序通量、更短的測(cè)序時(shí)間以及更低的測(cè)序成本，出現(xiàn)了第三代測(cè)序技術(shù)即單分子測(cè)序，其不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可在單分子水平上進(jìn)行檢測(cè)。雖然目前單分子測(cè)序技術(shù)在牧草研究上還不夠成熟，但隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，第三代測(cè)序技術(shù)勢(shì)必會(huì)在牧草研究上得到廣泛的應(yīng)用，為牧草種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用、牧草分子育種以及牧草優(yōu)異抗逆基因的挖掘提供更加準(zhǔn)確的參考，必將為推動(dòng)畜牧業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。