進展性缺血性腦卒中與阿司匹林抵抗及PEAR 1基因型的相關(guān)性研究

楊阿莉 胡亞梅 向 莉 周 瑤 劉俊然

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院(河南省人民醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450003

進展性缺血性腦卒中多被定義為發(fā)病后一段時間內(nèi)由進行性腦缺血所致的持續(xù)神經(jīng)功能惡化，其病死率和致殘率較非進展性腦卒中更高[1]。既往大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，阿司匹林的抗血小板聚集作用可以減少缺血性腦卒中的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和病死率。然而相當(dāng)一部分患者雖堅持服用阿司匹林，仍再次甚至多次發(fā)生缺血性心腦血管事件，檢測發(fā)現(xiàn)其血小板的活性或聚集率未得到有效抑制，此現(xiàn)象稱為阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)[2]。AR的發(fā)生可能涉及到多種綜合因素、環(huán)節(jié)的共同作用，如阿司匹林劑量不足、糖尿病、血小板對二磷酸腺苷(ADP)等聚集誘導(dǎo)劑的敏感性增高等，而非單一機制。目前，越來越多的研究開始重視遺傳因素在AR中的作用，有資料顯示血小板內(nèi)皮聚集受體1(PEAR 1)基因多態(tài)性可能為AR的影響因素。本研究旨在探討AR與進展性缺血性腦卒中的相關(guān)性及其與PEAR 1基因型的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1研究對象納入2016-05—2018-06住院的急性缺血性腦卒中患者236例，其中男127例，女109例，年齡36～88(68.3±11.9)歲。根據(jù)神經(jīng)功能變化情況將患者分為進展性腦卒中組和非進展性腦卒中組(簡稱進展組和非進展組)，其中進展組54例，男30例，女24例；非進展組182例，男97例，女85例。2組分別根據(jù)血小板聚集率的高低再分為AR和AS(阿司匹林抵抗，aspirin resistance)組。所有患者接受急性腦梗死常規(guī)藥物治療。

1．2入選標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)病，符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中急性缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，均為發(fā)病24 h后入院，患者及(或)家屬對研究過程及注意事項等知情同意，并簽署知情同意書，愿意配合治療和觀察。進展性腦卒中標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病7 d內(nèi)斯堪的那維亞卒中量表(Scandinavian Stroke Scale，SSS)評分中的意識水平、上肢、下肢或眼球運動降低≥2分和(或)語言功能降低≥3分[4]。

1．3排除標(biāo)準(zhǔn)(1)重度(50%以上)腦動脈狹窄；(2)心臟、血管炎、血管畸形、外傷等其他因素或病因不明的缺血性腦卒中；(3)血小板計數(shù)>300×109個/L或<100×109個/L；(4)近期應(yīng)用其他可能影響血小板功能的藥物，如氯吡格雷、西洛他唑、潘生丁、華法令、低分子肝素等；(5)阿司匹林過敏，目前有明確活動性消化道潰瘍或既往有大出血史；(6)他汀類藥物不耐受，如服藥后肝功能異常、肌酶升高等；(7)嚴(yán)重的各種血液系統(tǒng)病，嚴(yán)重的心功能、肝腎功能異常，嚴(yán)重的感染免疫性疾病，惡性腫瘤等；(8)有重大手術(shù)或創(chuàng)傷史。以上條件如果符合其中一條則不能納入。

1．4血小板功能檢測所有患者于入院后早餐前口服阿司匹林100 mg/d，連服7 d，次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)時采用抗凝真空管抽取肘靜脈血2.7 mL×2管，輕輕混勻后以1 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上層富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，剩余樣本再以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，收集乏血小板血漿(platelet-prro plasma，PPP)，用PPP調(diào)節(jié)PRP 至血小板計數(shù)200×109個/L～300×109個/L，將PRP和PPP分別加入兩支比濁管中，在血小板聚集儀(美國Helena 公司，四通道)中調(diào)節(jié)PRP和PPP的透光度；將AA(花生四烯酸)和ADP加入到PRP中，使兩者的終濃度分別為0.5 mg/mL和10 μmol/L，測定血小板聚集率。10 μmol/L ADP 誘導(dǎo)血小板最大聚集率≥70%以及0.5 mg/mL AA誘導(dǎo)血小板最大聚集率≥20%，符合上述兩項條件或只符合一條均判定為AR。

1．5 PEAR1基因型測定所有患者連服7 d阿司匹林后，同時采用抗凝管留取肘靜脈血做基因型測定。運用數(shù)字熒光分子雜交(digital fluorescence molecule hybridization，DFMH)技術(shù)檢測PEAR1基因位點rs12041331基因型。從血液樣本中收集白細胞：取1～1.2 mL 1×NH4Cl預(yù)處理液1.5 mL加入離心管中，再加入150～200 μL混勻的全血。上下顛倒混勻10次，室溫環(huán)境中靜置5 min，充分裂解紅細胞。室溫3 000 r/min離心5 min，將上層透明紅色液體吸取干凈，加入1 mL生理鹽水或1×NH4Cl徹底重懸白細胞，室溫3 000 r/min離心5 min，將上層液體吸干凈。向富集有白細胞的離心管中加入30～50 μL耀金保，反復(fù)吹打混勻。室溫環(huán)境中靜置30 min，期間再顛倒混勻2次，待檢測。向耀金分試劑中加入1.5～2 μL處理后的白細胞樣本，短暫離心，上機，通過SNP檢測所有患者的基因類型，基因型頻率=基因型例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1．6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用四格表χ2檢驗以及二分類Logistic回歸分析，計量資料先行正態(tài)性檢驗，認為近似正態(tài)分布后行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 2組一般情況和危險因素比較進展組糖尿病、高同型半胱氨酸以及有不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊患者比例高于非進展組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其他項目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2．2 AR發(fā)生率236例患者AR患者88例(進展組33例，非進展組55例)，AS患者148例(進展組21例，非進展組127例)。進展組與非進展組相比，AR與AS患者構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.994，P<0.01，表2)。AR與發(fā)病后進展呈正相關(guān)(OR=4.248，P<0.01，表3)。

2．3 PEAR 1基因不同類型分布比較PEAR 1基因型分布在進展組與非進展組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.095，P>0.05)，在AR組與AS組間也無明顯差異(χ2=0.419，P>0.05)。見表4。

3 討論

關(guān)于進展性腦卒中的定義，國際國內(nèi)迄今均尚未達成一致意見，目前采用較多的為2004年歐洲進展性腦卒中研究組的定義：SSS評分中，與基線評分相比，發(fā)病3 d的意識水平、上肢、下肢或眼球運動降低≥2分，和(或)語言功能降低≥3分，或發(fā)病72 h內(nèi)死亡[4]。國內(nèi)多數(shù)臨床研究中，對于進展性腦卒中的判定一般是指在一定時間窗內(nèi)(多為72 h～1周內(nèi))由進行性腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)功能惡化。目前尚無循證學(xué)證據(jù)證實何種方法可明確阻止進展性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展，本研究顯示，糖尿病、高同型半胱氨酸以及不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊等與進展性缺血性腦卒中相關(guān)，與既往研究一致[5-6]，但高齡、吸煙、高脂血癥等在部分研究中證實可能相關(guān)的危險因素在2組比較中卻未顯示出明顯差異，可能與樣本量有限有一定關(guān)系。也有學(xué)者認為，雖然這些均為常見腦血管

表1 2組入院時一般情況和危險因素比較

表2 2組阿司匹林敏感性比較 [n(%)]

表3 進展性腦卒中與AR相關(guān)性分析

表 4 PEAR 1基因不同類型分布比較 [n(%)]

病危險因素，但與卒中病情進展并無明確關(guān)系，而體溫升高、感染等病程中出現(xiàn)的并發(fā)癥等與卒中病情惡化密切相關(guān)[7-9]，因而為更好地指導(dǎo)臨床，早期預(yù)測與診斷進展性腦卒中仍需要更多的研究證據(jù)。

作為治療和預(yù)防缺血性腦卒中的關(guān)鍵性藥物，阿司匹林可使血小板環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)-1的絲氨酸位點乙酰化，導(dǎo)致COX 不可逆失活，進而阻礙血栓素(thromboxane，TXA)2與前列腺素(PGs)的生成，發(fā)揮抗血小板作用。大量基礎(chǔ)和臨床研究證明，阿司匹林能夠有效抑制血小板的凝聚，進而妨礙和阻止血栓的形成[10-12]；然而從作用機制來看，阿司匹林只能對血小板聚集過程中的一個環(huán)節(jié)起作用，不可能影響和阻斷急性血栓形成的整個過程，因此需要對阿司匹林是否能有效抑制血小板聚集及抑制的程度在相對客觀的層面上進行評價，以便給予臨床醫(yī)生一定的參考。實驗室AR概念是指阿司匹林不能抑制血小板活性或不能抑制依賴TXA的血小板功能，多數(shù)資料中將其定義為生化AR[13-15]。本研究應(yīng)用目前應(yīng)用較多的比濁法檢測血小板聚集率，以此評價阿司匹林抗血小板的效果，并比較非進展性和進展性腦卒中患者AR的情況，結(jié)果顯示，2組AR發(fā)生率有明顯差異，且AR與進展組呈正相關(guān)，提示AR與缺血性腦卒中病情惡化有一定關(guān)系。有研究顯示，AR與急性腦卒中患者臨床癥狀程度加重和影像學(xué)梗死體積增加均相關(guān)[16-18]。然而也有研究者認為AR可能并不存在，反倒是多數(shù)受試者服用腸溶型阿司匹林后因藥物吸收延遲和減少而導(dǎo)致“假抵抗”現(xiàn)象，因而臨床用藥劑型選擇時應(yīng)因需制宜[19-21]，該研究認為真正的AR很罕見，并且目前相關(guān)測試并無臨床應(yīng)用價值，現(xiàn)有的血小板功能檢測可能對于發(fā)現(xiàn)真正的“AR”作用有限。國內(nèi)也有專家認為根據(jù)血小板反應(yīng)性指導(dǎo)臨床實踐為時尚早。需要注意的是，盡管幾十年來就血小板功能檢測在實踐中的應(yīng)用尤其在阿司匹林的應(yīng)用進行了很多探索，但重要的指南并未明確規(guī)定將血小板測試作為一個實踐參考標(biāo)準(zhǔn)。

此外，盡管對于所謂AR的研究越來越多，但該現(xiàn)象的確切機制尚不完全明確，有研究者提出將AR的原因歸為三類。(1)臨床因素：服藥依從性差、生物利用度差、其他藥物的相互作用、急性冠脈綜合征、充血性心力衰竭、兒茶酚胺水平激增等。(2)細胞因素：COX-1的抑制不足、COX-2 mRNA的過度表達、紅細胞誘導(dǎo)的血小板聚集、去甲腎上腺素水平升高、尿8-異前列腺素的產(chǎn)生等。(3)基因因素：COX-1、膠原、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、vWF、P2Y2ADP受體的基因多態(tài)性等[22-24]。近年來，隨著遺傳學(xué)在各個領(lǐng)域的不斷發(fā)展，遺傳因素在AR中的作用也得到更多的研究和討論，曾經(jīng)有報道認為PEAR 1的基因多態(tài)性可能與阿司匹林抵抗相關(guān)[25-26]，然而本研究顯示進展性腦卒中與非進展性腦卒中PEAR1基因型分布并無顯著差異，AR與AS 2組PEAR 1基因型分布差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，樣本量有限可能是其中一方面原因，而既往研究中的確也有認為AR與PEAR 1、COX等的基因多態(tài)性并無關(guān)聯(lián)[27]。目前對于應(yīng)用阿司匹林的患者是否常規(guī)進行相關(guān)的基因檢測以指導(dǎo)臨床也尚無統(tǒng)一定論。AR的概念和其影響因素目前尚難以從某一方面或某幾方面明確闡述，未來需要有更多的探索。

急性進展性腦卒中神經(jīng)功能惡化與AR有密切關(guān)系，PEAR 1 基因型與卒中進展及AR無明確相關(guān)性。臨床工作者在應(yīng)用阿司匹林治療缺血性腦卒中時，應(yīng)根據(jù)實際情況及需求綜合考慮選擇是否進行阿司匹林敏感性及相關(guān)基因的檢測。