健腦益神丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉珊 苗立成 牟立娜 孟繁穎 侯明月

[摘要] 目的 建立健腦益神丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 對健腦益神丸中的炙甘草、葛根、酸棗仁、益智仁進(jìn)行顯微鑒別，對川芎、葛根采用薄層色譜法（TLC）進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法測定健腦益神丸中葛根素的含量，色譜柱為美國Agilent Zorbax Extend-C18，柱溫為室溫，流動相為甲醇-水（25∶75），流速為1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，進(jìn)樣量10 μL。 結(jié)果 該制劑的顯微鑒別明顯;TCL斑點(diǎn)清晰，陰性樣品無干擾;葛根素在40～240 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.999），平均回收率為99.98%，RSD為0.44%。 結(jié)論 該方法穩(wěn)定、可行，且專屬性高，可有效控制健腦益神丸的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 健腦益神丸;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);顯微鑒別;薄層色譜;葛根素

[中圖分類號] R286.0? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0024-05

健腦益神丸（原名益智養(yǎng)神健腦丸）[沈制字（2011）F10053]為解放軍第二一一醫(yī)院自制制劑，主要由黨參、益智、巴戟天、炒酸棗仁、防風(fēng)等中藥組成。具有滋陰補(bǔ)髓、開竅益腦的功效，治療腦疲勞具有良好的效果[1-2]。原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有對黨參、防風(fēng)進(jìn)行薄層鑒別。為嚴(yán)格控制制劑質(zhì)量，本研究擬對制劑中的炙甘草、葛根、酸棗仁、益智仁進(jìn)行顯微鑒別，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-14]，采用薄層色譜法（TLC）對川芎、葛根進(jìn)行定性鑒別，建立健腦益神丸中有效成分葛根素的含量測定方法，以期提高健腦益神丸質(zhì)量的可控性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外透射反射分析儀（上?？等A生化儀器制造有限公司）;Nikon YS 100顯微鏡 [南京江南光電（集團(tuán)）股份有限公司];電子天平（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司）;BSA2245電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;08A1608040薄層色譜點(diǎn)樣儀（上?？普苌邢薰荆?Waters 2489型高效液相色譜儀配Waters 2487型紫外檢測器（美國Waters公司）;UV-1601PC可見紫外光譜掃描儀（日本島津）。

1.2 試藥

葛根素對照品（批號：752-9002，HPLC≥99%）購于中國藥品生物制品檢定所;川芎對照藥材購于福建孟氏藥業(yè)有限公司（批號：20150601，20150704）;健腦益神丸由解放軍第二一一醫(yī)院制劑室提供（批號：20151001，20151002，20151003，20151101，20151102，20151103）。

甲醇為色譜純（美國ACS公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取數(shù)丸健腦益神丸，置研缽中，研碎，再取其粉末適量，置于顯微鏡下進(jìn)行顯微鑒別。

炙甘草：纖維束周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。葛根：纖維成束，周圍細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細(xì)胞的壁木化增厚。酸棗仁：內(nèi)種皮細(xì)胞棕黃色，表面觀多角形或類方形，垂周壁連珠狀增厚。益智仁：色素層細(xì)胞含紅棕色或深棕色，皺縮，界限不清楚，常碎裂成不規(guī)則色素塊。見圖1。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 川芎的薄層鑒別? 取健腦益神丸10 g，研碎，加乙醚20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾渣揮干，備用。濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即為供試品溶液。另取川芎對照藥材1 g，按上述方法制成對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[15]，吸取對照藥材溶液和供試品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在與對照藥材色譜相同的位置上，供試品顯相同顏色的熒光斑點(diǎn);陰性樣品色在相同位置上無干擾。見圖2。

2.2.2 葛根? 取“2.2.1”項(xiàng)下的備用濾渣，揮干乙醚，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取葛根素對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg葛根素的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[15]，吸取供試品溶液和對照品溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在與對照品色譜相同的位置上，供試品顯相同顏色的熒光斑點(diǎn);陰性樣品在相同位置上無干擾。見圖3。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件? 色譜柱為Agilent Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm）;柱溫為室溫;流動相為甲醇-水（25∶75）;流速為1.0 mL/min;檢測波長250 nm;進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)應(yīng)不低于2000。

2.3.2 對照品溶液制備? 取葛根素對照品精密稱取適量，加30%乙醇制成每1 mL約含0.1 mg葛根素的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備? 取健腦益神丸水丸適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙醚20 mL，超聲處理（功率180 W，頻率50 kHz）20 min，放冷，濾過，棄濾液，濾渣蒸干，加30%乙醇60 mL，搖勻，密塞，稱定重量，超聲25 min，冷卻，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性樣品溶液制備? 按制備工藝處方1/100取除葛根外其余所有藥材，按照制備工藝制備，制成葛根陰性樣品;按照“2.3.3”供試品溶液制備方法，制成陰性對照品溶液。

2.3.5 專屬性試驗(yàn)? 在“2.3.1”色譜條件下，精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照溶液在葛根素峰的位置無干擾峰干擾，專屬性強(qiáng)。見圖4。

2.3.6 線性關(guān)系的考察? 精密吸取濃度分別為40、80、120、160、200、240 μg/mL的葛根素對照品溶液各10 μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以對照品溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得葛根素回歸曲線方程：Y = 21497X+1.9437（r = 0.999）。葛根素在40～240 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn)? 取同一批號的供試品，照“2.3.3”項(xiàng)下處理方法，制成供試品溶液。照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得葛根素峰面積值。其峰面積的RSD值為2.69%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)? 取同一批號的供試品5份，每份約1 g，精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，分別測定，記錄峰面積。葛根素峰面積的RSD值為2.77%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取同一供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件，于0～16 h 內(nèi)每2 h檢測1次。1～16 h內(nèi)葛根素峰面積的RSD值為2.9%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn)? 稱取同一批號供試品5份，每份約0.5 g，精密稱定。精密加入3.64 mg/mL的葛根素對照品溶液1 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，供試品中葛根素的加樣回收率的RSD值為0.44%，表明該方法提取效果良好。見表1。

2.3.11 定量限與檢測限? 采用信噪比法，精密量取2.3.2項(xiàng)下的葛根素對照品溶液適量，逐級稀釋，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，當(dāng)S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限，當(dāng)S/N=3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測限，測定峰面積。葛根素的定量限、檢測限分別為1.91、0.53 μg/mL。

2.3.12 含量測定? 取6批樣品（20151001、20150902、20151003、20151101、20151102、20151103），每批3份，按2.3.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算6批樣品中葛根素含量。6批樣品葛根素的含量分別為6.0037、6.6698、6.0003、6.4610、5.6724、5.6358 mg/g。

3 討論

本研究確定了葛根、甘草、酸棗仁、益智的顯微鑒別方法，其重現(xiàn)性好，檢出高，視野清楚;采用TCL法對健腦益神丸中的川芎、葛根進(jìn)行了鑒別，結(jié)果色譜斑點(diǎn)清晰、分離度良好，且陰性無干擾;建立了健腦益神丸中葛根素含量測定的高效液相色譜法，該方法穩(wěn)定、可行、專屬性高，可有效控制健腦益神丸的質(zhì)量。

分析處方，并確定君藥。測定君藥的主要成分，發(fā)現(xiàn)黨參炔苷含量極低，樣品處理非常繁瑣，且文獻(xiàn)資料[16-26]對黨參含量測定很少;經(jīng)驗(yàn)證，本制劑中黨參炔苷含量測定重現(xiàn)性較差;處方中葛根素含量高，且葛根供試品處理簡單易行，文獻(xiàn)資料和2015版《中華人民共和國藥典》對葛根素的含量測定較規(guī)范，同時(shí)，葛根在處方中有重要地位。綜合比較，選定測定葛根素的含量。

本研究經(jīng)過大量的文獻(xiàn)資料分析和實(shí)驗(yàn)嘗試，確定用乙醚超聲20 min去雜質(zhì)后用30%乙醇超聲，可避免與葛根素極性相近的其他雜質(zhì)的影響干擾，且能得到較為純凈的葛根素。乙醚超聲去雜質(zhì)對葛根素提取率影響不大，故本研究分別考察了超聲15、20、25、30 min對葛根素提取率的影響，結(jié)果超聲25 min時(shí)峰面積最大，故選擇超聲25 min。根據(jù)上述考察指標(biāo)，乙醚超聲20 min去雜質(zhì)后，采用30%乙醇超聲提取25 min最優(yōu)。

本研究考察了流動相甲醇-水（30∶70）、甲醇-水（25∶75）、甲醇-水（22∶78）的分離效果，結(jié)果甲醇-水（25∶75）的分離效果最佳，故確定甲醇-水（25∶75）為流動相。

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（收稿日期：2017-12-29? 本文編輯：王? ?蕾）