D-來(lái)蘇糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

黃嘉葦 ，施 悅 ，張文立 *， 張 濤 ， 江 波 ，沐萬(wàn)孟

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫214122）

近年來(lái)，D-甘露糖的制備成為研究熱點(diǎn)。目前，主要通過(guò)提取、化學(xué)合成和生物手段制備D-甘露糖，提取是目前應(yīng)用較多的方法，但該方法易受到原料的季節(jié)影響[1-16]。化學(xué)法可將D-葡萄糖直接轉(zhuǎn)化為D-甘露糖，但這一過(guò)程需要化學(xué)催化劑，并必須嚴(yán)格控制溫度和酸濃度[17]。利用生物法進(jìn)行單糖之間的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-甘露糖具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和且成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前，甘露糖的生物法制備主要以D-葡萄糖或D-果糖為原料，利用單糖異構(gòu)或差向異構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。D-來(lái)蘇糖異構(gòu)酶 （D-LI，EC 5.3.1.15）、D-甘露糖異構(gòu)酶（EC 5.3.1.7）和纖維二糖差向異構(gòu)酶（EC 5.1.3.11）都已被報(bào)道具備D-甘露糖生產(chǎn)能力。但是，目前鑒定的D-甘露糖異構(gòu)酶大多催化效率不高，反應(yīng)溫度也較低。纖維二糖差向異構(gòu)酶是目前已報(bào)道唯一可以催化葡萄糖差向異構(gòu)化生成甘露糖的酶，但該酶的轉(zhuǎn)化率較低，同時(shí)會(huì)生成大量D-果糖為副產(chǎn)物[18]。

D-來(lái)蘇糖異構(gòu)酶是一種醛酮糖異構(gòu)酶，可以有效催化D-木酮糖和D-來(lái)蘇糖以及D-果糖和D-甘露糖之間的差向異構(gòu)反應(yīng)[19]。因其較寬的底物特異性，利用D-LI生產(chǎn)D-甘露糖也受到了研究者的關(guān)注。目前，已有9種來(lái)自不同微生物的D-LI被報(bào)道。1956年，Anderson and Allison首次報(bào)道了來(lái)自Aerobacter aerogenesPRL-R3 的 D-LI[20]，該酶具有催化D-來(lái)蘇糖和D-甘露糖的能力。在這之后，其他來(lái)源的D-LI陸續(xù)被鑒定，分別來(lái)源于Cohnella laevoribosiiRI-39[21]、Providencia stuartiiKCTC 2568[22]、Serratia proteamaculansKCTC 2936[23]、Escherichia coliO157：H7[24]、Bacillus subtilis168[25]、Bacillus licheniformisDSM13[26]、Dictyoglomus turgidumDSM 6724[27]和Thermosediminibacter oceaniDSM 16646[28]。目前，大部分研究主要集中于挖掘D-LI的新的微生物來(lái)源及改進(jìn)其對(duì)D-來(lái)蘇糖的催化效率，而利用D-LI生物生產(chǎn)D-甘露糖的研究相對(duì)較少，僅有來(lái)自于P.stuartiiKCTC 2568[22]，S.proteamaculansKCTC 2936[23]和T.oceaniDSM 16646[28]的 D-LI 被研究用于催化D-果糖生物轉(zhuǎn)化D-甘露糖。

Peptococcaceae bacterium1109是從牛糞中發(fā)現(xiàn)的一種嗜熱細(xì)菌，Town JR等已經(jīng)將P.bacterium1109的全基因組序列解析公布在GenBank上，登錄號(hào)為L(zhǎng)DJB01000001.1。該微生物的全基因組中存在可能編碼D-LI的推定基因，登陸號(hào)為：KLU40859.1，含有180個(gè)氨基酸[29]。作者克隆了來(lái)源于P.bacterium1109的D-LI推定基因，將其導(dǎo)入到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)重組酶進(jìn)行分離純化操作，研究了其酶學(xué)性質(zhì)以及從D-果糖生物轉(zhuǎn)化D-甘露糖，為酶法工業(yè)化生產(chǎn)D-甘露糖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5α：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物 5，氯化鈉10，胰蛋白胨10，氨芐霉素的終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

LB固體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物 5，氯化鈉10，胰蛋白胨10，瓊脂添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%，氨芐霉素的終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

1.3 主要試劑與材料

酵母提取物、胰蛋白胨、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）：購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；D-果糖、D-甘露糖、D-來(lái)蘇糖、D-木酮糖、L-核糖、L-核酮糖：購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

蛋白電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Carbomix Ca-NP10色譜柱：美國(guó)賽分科技公司產(chǎn)品；TSKgel G3000 SWXL凝膠色譜柱：默隆 （上海）實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 重組D-LI的基因克隆及誘導(dǎo)表達(dá)P.bacterium1109是一種耐熱型微生物，克隆其D-LI基因（GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)DJB01000001.1，編碼氨基酸序列登錄號(hào)為ADL08607.1）。在5’端和3’端分別引入酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI，至載體pET-22b（+）上，獲得重組質(zhì)粒pET-Peba-D-LI轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21（DE3）中表達(dá)。在基因序列的C’末端融合6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，以便于重組蛋白純化。

1.5.2 重組D-LI的純化分離 挑取構(gòu)建成功的重組菌的單菌落接種到4 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種至200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～0.8，添加IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1 mmol/L，28℃、200 r/min低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。收集誘導(dǎo)表達(dá)完成的菌體，用裂解液洗滌重懸超聲破碎后的菌體，將重懸液在4℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾上清液，使用螯合Ni2+的填充層析柱進(jìn)行酶純化操作。

在低溫條件下，用5個(gè)柱體積的去離子水沖洗Ni2+填充層析柱；再用 3～4個(gè)柱體積的Binding Buffer（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）平衡Ni2+層析柱；隨即將粗酶液加入層析柱中，粗酶液緩緩流經(jīng)Ni2+層析柱，使目的蛋白與Ni2+層析柱充分結(jié)合；然后用5個(gè)柱體積的Wash Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）洗脫雜蛋白；最后用5個(gè)柱體積的 Elution Buffer （500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）洗脫目的蛋白。使用含EDTA的磷酸鹽緩沖溶液 （10 mmol/L EDTA，50 mmol/L，pH 7.5）透析 6 h，螯合去除酶液中的金屬離子；之后用不含EDTA的磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L，pH 7.5）透析兩次，每次 6 h，除去殘存的EDTA，得到純酶液。

1.5.3 重組D-LI的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 利用丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)重組蛋白質(zhì)單亞基相對(duì)分子質(zhì)量，電泳的分離膠和濃縮膠丙烯酰胺質(zhì)量濃度分別為12 g/dL和5 g/dL，考馬斯亮藍(lán)R250作為蛋白顯色劑。

利用配備了紫外檢測(cè)器和TSKgel G2000SWxl凝膠色譜柱的高效液相系統(tǒng)檢測(cè)重組酶的全相對(duì)分子質(zhì)量。HPLC條件為：流動(dòng)相：100 mmol/L KH2PO4，100 mmol/L Na2HPO4， 質(zhì) 量 分 數(shù) 0.05%NaN3，100 mmol/L Na2SO4，pH 6.8； 流量：1 mL/min。柱溫：23℃；檢測(cè)器條件：UV 280 nm。

1.5.4 重組D-LI的酶活測(cè)定 D-甘露糖轉(zhuǎn)化的酶反應(yīng)體系為 1 mL，D-果糖 10 mmol/L，CoCl21 mmol/L，磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）50 mmol/L，重組酶0.1 U/mL。在70℃條件下反應(yīng)10 min，煮沸10 min終止酶反應(yīng)。

D-甘露糖檢測(cè)：將反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物離心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）， 使用 0.22 μm 微濾膜過(guò)濾上清液，稀釋后使用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件：Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters示差折光檢測(cè)器（RI），Carbomix Ca-NP10 色譜柱（10 μm，D7.8 mm×300 mm），0.22 μm 濾膜過(guò)濾后的超純水作為流動(dòng)相，柱溫85℃，流量0.6 mL/min。

酶活單位U定義：pH 7.5、70℃的條件下，單位時(shí)間內(nèi)酶催化D-果糖產(chǎn)生1 μmol的D-甘露糖所需要的加酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.5.5 重組D-LI的最適溫度和熱穩(wěn)定性測(cè)定 將1 mL的酶反應(yīng)體系分別置于不同溫度 （45～85℃）條件下參照1.5.4方法測(cè)定各反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活，確定最適反應(yīng)溫度，將酶活最高的一組設(shè)為相對(duì)酶活100%。

將純化后的酶液分別在70～80℃的條件下保溫，每隔30 min間隔取樣，并立即在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定活性。定義初始酶活為相對(duì)酶活100%。

為研究重組酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使用TA Nano-DSC測(cè)定該重組酶Tm值。以酶的透析液作為空白基線，將DSC儀器平衡300 s。從30℃加熱至110℃，升溫速率為1℃/min。使用Nano Analyze軟件對(duì)DSC數(shù)據(jù)進(jìn)行校正分析，并計(jì)算重組酶的Tm值。

1.5.6 重組D-LI的最適pH 將1 mL的酶反應(yīng)體系分別置于不同pH（pH 4.5～9.0）條件下測(cè)定各反應(yīng)pH下的相對(duì)酶活，確定最適反應(yīng)pH，并將酶活最高的一組設(shè)為相對(duì)酶活100%。實(shí)驗(yàn)中用到3種不同的緩沖體系：醋酸鹽緩沖液（pH 4.5～6.0）；磷酸鹽緩沖液（pH 6.0～7.5）；Tris-HCl緩沖液（pH 7.5～9.0）。

1.5.7 金屬離子對(duì)重組D-LI酶活的影響 在1 mL的酶反應(yīng)體系添加1 mmol/L不同種類(lèi)的二價(jià)金屬離子 （Co2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+），測(cè)定不同種類(lèi)的金屬離子對(duì)酶催化反應(yīng)的影響，確定酶反應(yīng)的最適離子，并將酶活最高的一組設(shè)為相對(duì)酶活100%。

1.5.8 重組D-LI動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 研究重組酶的底物特異性和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，分別以5～200 mmol/L的D-果糖、D-甘露糖、D-來(lái)蘇糖、L-核糖作為底物，在最適條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定酶活。通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，并計(jì)算出重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)：米氏常數(shù)Km值、催化常數(shù)kcat值和催化效率kcat/Km值。

1.5.9 重組D-LI平衡轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 為測(cè)定D-果糖和D-甘露糖的反應(yīng)平衡轉(zhuǎn)化率，以10 mmol/L的D-果糖為底物，加入1 mmol/L Co2+和0.3 U/mL重組酶，在45～85℃的條件下，反應(yīng)48 h，測(cè)定D-甘露糖轉(zhuǎn)化率。

1.5.10 D-甘露糖的大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化 為研究D-果糖和D-甘露糖之間的大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化，分別以100、300、500 g/L的高質(zhì)量濃度D-果糖溶液為底物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間生物轉(zhuǎn)化。加入1 mmol/L Co2+和0.3 U/mL重組酶，在70℃，pH 7.5條件下反應(yīng)，測(cè)定重組酶的催化反應(yīng)進(jìn)程。間隔時(shí)間取樣滅活，檢測(cè)其中D-甘露糖生成量。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組D-LI的質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)

2.1.1 重組D-LI的重組質(zhì)粒構(gòu)建P.bacterium1109微生物的全基因組序列已在NCBI中公布，登錄號(hào)為：LDJB01000001.1，經(jīng)預(yù)測(cè)該微生物存在基因片段能夠編碼D-LI，基因片段KLU40859全長(zhǎng)543 bp，可編碼180個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為20.35×103。在該基因片段上下游引物5’端分別引入NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成后連接到pET-22b（+）表達(dá)載體（圖1），獲得重組質(zhì)粒pET22b-peba-D-LI。為了簡(jiǎn)化重組蛋白的純化步驟，在重組質(zhì)粒C-端添加了6×his-tag標(biāo)簽。

圖1 重組D-LI質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Constructed recombinant plasmid of D-LI

2.1.2 重組D-LI的氨基酸序列分析 通過(guò)Espript軟件（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/），將來(lái)源于P.bacterium1109的D-LI的氨基酸序列與已經(jīng)報(bào)道的其他8種D-LI的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)（圖2）。高亮紅色表示氨基酸殘基100%相同；藍(lán)色方框中字體紅色表示75%以上的氨基酸殘基相同；空白表示氨基酸殘基完全不同。結(jié)合已報(bào)道的來(lái)源于B.sutbilis的D-LI晶體結(jié)構(gòu)可以看出，所有已鑒定的D-LI在關(guān)鍵位點(diǎn)上的氨基酸殘基上具有嚴(yán)格的保守或較高的相似度。例如，二價(jià)金屬離子調(diào)節(jié)位點(diǎn)上 （103、105、171位的 3個(gè) His和 110位的Glu）；與D-果糖和離子結(jié)合相關(guān)的6個(gè)氨基酸殘基（K90，K108，E110，E186，D193，N917 和 R205）， 除了與D-果糖的O-2結(jié)合相關(guān)的N917，其余氨基酸殘基均為嚴(yán)格保守，同時(shí)，在917位點(diǎn)上，除了S.proteamaculansKCTC 2936[23]，E.coliO157：H7[24]，B.licheniformisDSM13[26]，其余報(bào)道的D-LI的該位點(diǎn)上氨基酸都是Ile。而通過(guò)氫鍵與D-果糖的O-4結(jié)合的203與208位點(diǎn)處的氨基酸殘基并不保守，可能是造成不同的酶對(duì)底物特異性識(shí)別和親和力大小不同的原因。

2.1.3 重組D-LI在E.coliBL21（DE3）中的表達(dá)將來(lái)源于P.bacterium1109的D-LI按照1.5.2方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組質(zhì)粒C-端末尾引入的6×histag標(biāo)簽可以高度親和 Ni2+，使用 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和色譜快速純化目的蛋白。將誘導(dǎo)純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)（圖3）。分析結(jié)果顯示，全細(xì)胞及純酶樣品在21×103處出現(xiàn)明顯的目的條帶，與重組蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量20.78×103結(jié)果相一致。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，該處的條帶逐漸加寬，純化后的酶液電泳條帶單一，純度達(dá)到電泳純。證明該D-LI目的基因的大腸桿菌基因工程菌成功構(gòu)建，并且誘導(dǎo)表達(dá)。

2.1.4 重組D-LI的全相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 使用TSKgel G2000SWxl凝膠色譜柱，利用紫外檢測(cè)器測(cè)定來(lái)自P.bacterium1109的D-LI的蛋白全相對(duì)分子質(zhì)量。繪制蛋白全相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），參照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出該重組酶的相對(duì)分子質(zhì)量大約為42×103，SDS-PAGE結(jié)果顯示該酶的單亞基相對(duì)分子質(zhì)量為21×103，因此，該酶為二聚體結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)被鑒定的來(lái)源于C.laevoribosiiRI-39[21]、P.stuartiiKCTC 2568[22]、S.proteamaculansKCTC 2936[23]、E.coliO157：H7[24]、D.turgidumDSM 6724[27]以及T.oceaniDSM 16646[28]的D-LI均為二聚體結(jié)構(gòu)，其中， 來(lái)源于P.stuartiiKCTC 2568[22]，D.turgidumDSM 6724[27]及T.oceaniDSM 16646[28]的酶 相 對(duì) 分 子質(zhì)量與本實(shí)驗(yàn)的重組酶相近，為44×103。

圖2 D-LI的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of amino acids from D-LI

圖3 純化后的重組蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein

2.2 重組D-LI的酶學(xué)性質(zhì)鑒定

2.2.1 重組D-LI的最適溫度及溫度穩(wěn)定性 溫度是影響酶催化效率的重要條件之一。較高的溫度有利于增強(qiáng)化學(xué)反應(yīng)速率，但溫度升高的同時(shí)，也會(huì)加速酶蛋白的變性，降低酶的催化效率[30-31]。通過(guò)測(cè)定45～85℃的酶活力，得到該酶隨著溫度變化的酶活力曲線（圖5）?？梢钥闯?，在45～70℃，該酶的活力隨著溫度的升高而增加。溫度達(dá)到70℃時(shí)，酶的活力最高。并且在60～70℃時(shí)，重組酶有較高的催化效率。當(dāng)溫度超過(guò)70℃時(shí)，重組酶的活力急劇下降，80℃時(shí)酶活僅為保留最高酶活的20%。

圖4 D-LI全相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定Fig.4 Determination of total molecular weight of D-LI

將純酶溶液在70、75、80℃條件下保溫，定時(shí)取樣觀察酶的活力損失情況。定義初始酶活為100%，采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，將不同時(shí)間酶的相對(duì)酶活作圖（圖6）?？梢钥闯觯撁冈?0℃和75℃條件下比較穩(wěn)定，70℃條件下保溫2 h，仍能保持84%的酶活，75℃保溫1.5 h，酶活為81%。當(dāng)在80℃保溫時(shí)，酶活損失較快，保溫1.5 h后，酶活下降至約50%。在 70、75、80°℃下，酶的衰減常數(shù)分別為0.1040、0.1258、0.4309， 相應(yīng)的半衰期分別為 6.66、5.51、1.61 h。通過(guò)TA Nano-DSC測(cè)得該重組酶的Tm值為67.20℃（圖7），說(shuō)明該重組酶蛋白的熱穩(wěn)定性較高。

圖5 溫度對(duì)重組D-LI催化活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the enzyme activity of the recombinant D-LI

圖6 重組D-LI的熱穩(wěn)定性Fig.6 Effect of temperature on the thermostability of the recombinant D-LI

圖7 重組D-LI的DSC分析Fig.7 DSC analysis of the recombinant D-LI

目前已報(bào)道的D-LI的最適溫度大多在40至75℃之間，來(lái)源于D.turgidumDSM 6724[27]的D-LI最適溫度為75℃，是目前最適反應(yīng)溫度最高的DLI。盡管來(lái)源于P.bacterium1109的最適溫度略低于D.turgidumDSM 6724，但是相對(duì)而言有較好的熱穩(wěn)定性，在70、75、80℃的條件下半衰期為6.66、5.51和1.61 h，而來(lái)源于D.turgidumDSM 6724的D-LI在這幾個(gè)溫度條件下半衰期分別為2.8、1.8和0.8 h。 此外， 除了C.laevoribosiiRI-39[21]，D.turgidumDSM 6724[27]以及T.oceaniDSM 16646[28]是來(lái)源于耐熱微生物，其他報(bào)道的D-LI都來(lái)源于嗜溫微生物。在醛酮糖異構(gòu)酶的工業(yè)化應(yīng)用中，來(lái)源于耐熱微生物的酶往往具有更高的熱穩(wěn)定性，也更適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。綜合比較已報(bào)道的D-LI，本研究鑒定的D-LI具有較高的最適反應(yīng)溫度和較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，具有一定工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

2.2.2 重組D-LI的最適pH 酶的活性易受到體系pH的影響。酶在不同的pH條件下活性會(huì)有所不同，不同的酶的有各自的最適pH。通過(guò)測(cè)定pH 4.5至9.0的pH值緩沖環(huán)境下重組D-LI酶活的變化（圖8），發(fā)現(xiàn)該酶的最適pH條件為pH 7.5的磷酸鹽緩沖體系。pH在4.5至5.5之間時(shí)，相對(duì)酶活較低，隨著酸性的增強(qiáng)，酶活急劇下降，可見(jiàn)該酶在酸性條件下時(shí)較為敏感。pH大于7.5時(shí)，酶活相對(duì)穩(wěn)定，隨著堿性增強(qiáng)，酶活損失較慢，說(shuō)明該重組酶在中性及弱堿性環(huán)境下較為穩(wěn)定。

綜合比較目前已報(bào)道的D-LI可以發(fā)現(xiàn)，大部分酶的最適pH為中性偏堿性，而來(lái)源于C.laevoribosiiRI-39[21]和T.oceaniDSM 16646[28]最 適pH為6.5。在糖酶的催化反應(yīng)中，弱酸性環(huán)境有利于抑制碳水化合物的美拉德反應(yīng)，減少非酶褐變和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，有利于工業(yè)化生產(chǎn)[32-33]。

圖8 pH對(duì)重組D-LI催化活性的影響Fig.8 Effect of pH on the enzyme activity of the recombinant D-LI

2.2.3 重組D-LI的最適金屬離子 金屬離子可以作為輔助因子或激活劑，在酶反應(yīng)中起著十分重要的作用。在單糖異構(gòu)酶中，金屬離子往往對(duì)酶活有十分重要的影響。作者研究了不同二價(jià)金屬離子對(duì)重組D-LI酶活的影響（表1）。以純化后經(jīng)EDTA處理的原始酶作為對(duì)照組，可以看出，金屬離子對(duì)酶反應(yīng)有比較大的影響。其中，Co2+可以將酶活提高為對(duì)照組的 170 倍以上。 Mn2+、Ca2+、Ba2+以及 Mg2+也對(duì)酶反應(yīng)有一定促進(jìn)作用。添加Mn2+時(shí)的酶活達(dá)到未添加時(shí)的143%，添加Ca2+時(shí)的酶活達(dá)到未添加時(shí)的127%，添加Ba2+時(shí)的酶活達(dá)到未添加時(shí)的147%，添加Mg2+時(shí)的酶活達(dá)到未添加時(shí)的123%。另外幾種離子 Ni2+、Fe2+和 Zn2+的添加會(huì)抑制酶活，添加 Cu2+后幾乎沒(méi)有酶活。

表1 金屬離子對(duì)D-LI活性的影響Table 1 Effect of metal ions on the enzyme activity of D-LI

目前鑒定的D-LI中，除了來(lái)源于D.turgidumDSM 6724[27]的D-LI最適金屬離子也是Co2+，其他所有被報(bào)道的D-LI的最適金屬離子都是Mn2+。大部分D-LI可以被Mn2+或Co2+激活，但是來(lái)源于C.laevoribosiiRI-39[21]和P.stuartiiKCTC 2568[22]的 DLI活性卻會(huì)被Co2+抑制。離子在許多單糖異構(gòu)酶的催化作用中起著十分重要的作用，如L-阿拉伯糖異構(gòu)酶[34]，酮糖 3-差向異構(gòu)酶[35]，L-鼠李糖異構(gòu)酶[36]和D-葡萄糖異構(gòu)酶[37]。此外，金屬離子與一些糖酶的穩(wěn)定性有關(guān)。例如，添加金屬離子可以改善D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)體和L-鼠李糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[38-39]。

2.2.4 重組D-LI的動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究 分別以5-200 mmol/L D-來(lái)蘇糖、D-甘露糖、D-果糖、D-核糖為底物，研究重組D-LI的底物特異性（表2）。在最適條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)后通過(guò)HPLC測(cè)定酶活性。通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，計(jì)算重組D-LI的米氏常數(shù)Km值、催化常數(shù)kcat值和催化效率kcat/Km值。通過(guò)Km值，可以直觀看出酶與底物親和力的大小，Km值越大代表酶與底物的親和力越校；kcat代表酶的催化速率，kcat值越大，代表酶催化速率越高；kcat/Km則代表酶反應(yīng)的催化效率，kcat/Km值越大，則酶的催化效率越高[40]。結(jié)果顯示，該重組酶的最適底物是D-來(lái)蘇糖，比酶活可以達(dá)到為（7.755±0.3）U/mg。以 D-甘露糖為底物時(shí)，比酶活為 （5.424±0.1）U/mg，D-果糖為底物時(shí)， 比酶活為（2.544±0.2）U/mg，以L-核糖為底物時(shí)，比酶活為（1.848±0.1） U/mg。

表2 來(lái)源于P.bacterium 1109的D-LI比酶活與動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Specific activities and kinetic parameters of D-LIfrom P.bacterium 1109

以D-來(lái)蘇糖為底物時(shí)，Km值和kcat/Km值分別為 12.868 mmol/L、58.032 L/（mmol min）；以 D-甘露糖為底物時(shí)，Km值和kcat/Km值分別為33.467 mmol/L、10.138 L/（mmol·min）。以 D-果糖為底物時(shí)，Km值和kcat/Km值分別為 21.092 mmol/L、7.353 L/（mmol·min）；以L-核糖為底物時(shí)，Km值和kcat/Km值分別為1 130.088 mmol/L、3.628 L/（mmol·min）。 可以看出，該重組酶對(duì)D-來(lái)蘇糖、D-甘露糖、D-果糖和L-核糖都有催化活性，且相對(duì)活性依次降低；該重組酶對(duì)D-來(lái)蘇糖的Km值最小，說(shuō)明與D-來(lái)蘇糖的親和力最強(qiáng)；同時(shí)kcat/Km值較大，說(shuō)明D-來(lái)蘇糖有較高的催化效率，最適底物為來(lái)蘇糖，為D-LI。對(duì)比其他幾種已報(bào)道的D-LI的動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以看出，來(lái)自P.bacterium1109的D-LI是目前已報(bào)道的對(duì)D-果糖親和力最強(qiáng)，催化效率最高的酶，這進(jìn)一步說(shuō)明了該酶在D-果糖生物生產(chǎn)D-甘露糖的工業(yè)應(yīng)用中具有較高的價(jià)值。

2.2.5 重組D-LI的平衡轉(zhuǎn)化率 為測(cè)定D-果糖和D-甘露糖的反應(yīng)平衡轉(zhuǎn)化率，以10 mmol/L D-果糖為底物，在最適條件下，50～80℃酶反應(yīng)48 h，測(cè)定D-甘露糖轉(zhuǎn)化率（表3）。在40～70℃時(shí)，該反應(yīng)的平衡轉(zhuǎn)化率受溫度影響不大，在24.2%至25.2%之間，并且隨著溫度的升高，甘露糖的轉(zhuǎn)化率逐漸變小，平衡朝向果糖轉(zhuǎn)移。而反應(yīng)溫度高于70℃時(shí)，甘露糖的轉(zhuǎn)化率很快降到10%左右，這可能是由于該酶在70℃以上時(shí)迅速失活，同時(shí)反應(yīng)平衡也隨著溫度的升高進(jìn)一步向果糖移動(dòng)。目前已報(bào)道的D-LI大部分平衡轉(zhuǎn)化率在20%左右，除了來(lái)源于B.licheniformisDSM13[26]的轉(zhuǎn)化率較高，為30%，來(lái)源于P.stuartiiKCTC 2568[22]的轉(zhuǎn)化率與該酶相近，都是25%。

表3 不同溫度下D-甘露糖的平衡轉(zhuǎn)化率Table 3 Transformation ratio of D-mannose at different temperatures

2.2.6 D-甘露糖的大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化 為研究D-果糖和D-甘露糖的底物轉(zhuǎn)化情況，分別以100、300、500 g/L的D-果糖為底物，在最適條件下，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間生物轉(zhuǎn)化，每隔一定時(shí)間取樣滅活，稀釋后檢測(cè)D-甘露糖生成量（圖9）。以100 g/L的D-果糖為底物時(shí)，反應(yīng)3 h平衡時(shí)D-甘露糖的轉(zhuǎn)化率為23.81%，D-甘露糖質(zhì)量濃度為23.81 g/L。以300 g/L的D-果糖為底物時(shí)，反應(yīng)5 h達(dá)到平衡狀態(tài)，D-甘露糖反應(yīng)平衡時(shí)生成率為22.35%，D-甘露糖質(zhì)量濃度為67.05 g/L。以500 g/L的果糖為底物時(shí)，反應(yīng)8 h后達(dá)到平衡狀態(tài)，平衡時(shí)甘露糖的產(chǎn)率為19.17%，甘露糖質(zhì)量濃度為96.85 g/L。底物質(zhì)量濃度的增加可以促進(jìn)反應(yīng)平衡向右移動(dòng)，得到更多的產(chǎn)物，但當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡之后，產(chǎn)物的抑制作用會(huì)使轉(zhuǎn)化率輕微降低。

圖9 D-甘露糖的生物轉(zhuǎn)化Fig.9 D-Mannose production from D-fructose by D-LI

3 結(jié)語(yǔ)

作者鑒定了一株來(lái)源于耐熱微生物P.bacterium1109的D-LI，并將其應(yīng)用于D-甘露糖的生物法合成。通過(guò)合成該D-LI的編碼基因，將其連接到質(zhì)粒pET-22b（+）載體上，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌E.coliBL21（DE3）中，實(shí)現(xiàn)了該酶在大腸桿菌中的外源表達(dá)。對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化后研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)，以D-果糖為底物時(shí)，重組表達(dá)的D-LI的比酶活可達(dá)1.2 U/mg。該重組D-LI的最適pH為7.5，最適溫度為70℃。該重組酶在中性及弱堿性環(huán)境下和70～75℃的溫度下有較好的熱穩(wěn)定性，70和 75℃的半衰期分別為 6.66、5.51 h。Co2+可以顯著提高該酶的活力。研究其底物特異性發(fā)現(xiàn)，該D-LI的最適底物為D-來(lái)蘇糖，但是對(duì)D-果糖也有較高的親和力和相對(duì)較高的催化效率。在最適條件下以500 g/L的果糖為底物，反應(yīng)8 h達(dá)到平衡，平衡轉(zhuǎn)化率達(dá)19.17%。