新疆維吾爾族、漢族抗結(jié)核藥物性肝損傷患者IL-10分泌水平的研究

劉 向, 楊 麗, 鄭 甜, 陳偉嵐, 李國昌

(1. 新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院結(jié)核科，新疆 烏魯木齊 830049； 2. 新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830049； 3. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，新疆 石河子 832008)

抗結(jié)核藥物所導(dǎo)致肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATDLI)常使抗結(jié)核治療中斷，或使治療方案更改，導(dǎo)致患者療效降低和結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥等，直接影響對結(jié)核病的控制效果。隨著人們對藥物性肝損傷研究的不斷深入，參與肝損傷疾病的細胞因子的分泌量越來越引起人們的關(guān)注，免疫細胞在活化過程中釋放的細胞因子在肝損傷機制中發(fā)揮著重要作用[1]。其中白介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種重要的細胞因子，有研究報道IL-10作為一種抗炎因子，參與多種免疫炎癥的病理過程，肝組織可分泌IL-10對抗細胞色素酶介導(dǎo)的藥物免疫毒性和細胞毒性，抑制炎癥介質(zhì)、氧自由基等的釋放[2-3]。并且人們發(fā)現(xiàn)細胞因子不同的基因型呈現(xiàn)不同的表達量，且不同人群IL-10多態(tài)性的分布存在差異[4]。IL-10的分泌量受基因的調(diào)控，由于不同種族人群的基因存在差異，因此其IL-10水平亦不同。

全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，新疆是全國結(jié)核病高流行區(qū)，不同民族的結(jié)核病發(fā)病率也存在差異，維吾爾族發(fā)病率高于漢族和其他少數(shù)民族人群[5]。對此，本項目在等同的實驗條件下檢測新疆區(qū)域內(nèi)維吾爾族與漢族人群中ATDLI患者IL-10分泌水平，同時與肺結(jié)核患者血清IL-10分泌水平比較，從而探討兩民族患者由于病情變化而導(dǎo)致IL-10分泌水平的變化及其在肝損傷中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院2015年1月—2016年11月確診為ATDLI患者。維吾爾族為ATDLI患者均篩選新疆區(qū)域內(nèi)原居住者，雙親無異族通婚史。項目通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[6]進行肺結(jié)核的診斷。

1.2.2 ATDLI患者確診 結(jié)核病患者在接受抗結(jié)核藥物治療過程中出現(xiàn)肝損傷，并且與抗結(jié)核藥物的使用直接相關(guān)，診斷依據(jù)滿足《抗結(jié)核藥所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》[7]的相關(guān)條件。

1.2.3 肝損傷嚴(yán)重程度分級標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局(State Food and Drug Administration, SFDA)藥品評價中心(Center for Drug Reassessment，CDR)制定的《抗結(jié)核藥所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》對肝損傷嚴(yán)重程度進行分級[7]。

1.2.4 ATDLI患者納入標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)確診的肺結(jié)核患者在抗結(jié)核藥物治療前臨床生化檢查均正常，包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)和總膽紅素(TBiL)均在正常范圍內(nèi)(ALT<40 U/L，AST<40 U/L，AKP<150 U/L，TBiL<23.1 μmol/L)[8-9]。經(jīng)抗結(jié)核藥物治療且在抗結(jié)核藥物治療過程中出現(xiàn)肝損傷，并確保在抗結(jié)核藥物治療過程中未合并服用可導(dǎo)致肝損傷的其他藥物。

1.2.5 抗結(jié)核藥物繼發(fā)肝損傷患者排除標(biāo)準(zhǔn) (1)HIV感染、慢性嗜肝病毒感染的肝炎患者；(2)抗結(jié)核治療前患者ALT、AST或TBiL檢測結(jié)果非正常參考范圍內(nèi)；(3)合并自身免疫性肝炎、HIV感染、酒精性肝病、腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病及其他感染性疾??；(4)由其他藥物導(dǎo)致肝功能損傷的患者。

1.3 試劑及儀器 IL-10 ELISA試劑盒為R&D公司產(chǎn)品(批號330244)，Thermo Varioskan Flash酶標(biāo)儀為Thermo Scientific公司產(chǎn)品，TGL-16B型離心機為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品，恒溫水浴鍋為江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。

1.4 研究方法

1.4.1 標(biāo)本采集 在接受抗結(jié)核藥物治療過程中發(fā)生肝損傷患者于清晨空腹抽取靜脈血2 mL，4 000 r/min 離心5 min，分離血清，置于-20℃保存待檢測。

1.4.2 檢測方法 采用ELISA試劑盒(IL-10 ELISA Kit)測定肝損傷患者IL-10分泌量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，應(yīng)用 Thermo Varioskan Flash酶標(biāo)儀在450 nm處測定OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為：500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8 pg/mL，相關(guān)系數(shù)(r2)=0.9998，變異系數(shù)(CV)=0.0879。在570 nm處波長處進行校正，結(jié)果用四參數(shù)擬合曲線進行計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出IL-10的濃度。

2 結(jié)果

2.1 基本資料 本研究共納入ATDLI漢族組患者100例(男性67例，女性33例)，維吾爾族組患者135例(男性73例，女性62例)。年齡18～65歲，漢族組患者平均年齡(38.02±15.77)歲，維吾爾族組患者(40.53±16.44)歲；體重：漢族組(59.35±10.23)kg，維吾爾族組(58.39±12.97)kg；身高：漢族組(168.30±7.98)cm，維吾爾族組(166.02±7.83)cm；ALT：漢族組[127.3(80～394)]U/L，維吾爾族組[113.2(80～450)]U/L；AST：漢族組[156.5(40～360)]U/L，維吾爾族組[135.7(40～432)]U/L；兩組患者抗結(jié)核藥物治療方案均為異煙肼片(H)+利福平(R)+吡嗪酰胺片(Z)+鹽酸乙胺丁醇片(E)或 H+R+Z 或H+R+E。兩組患者的性別構(gòu)成比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者的年齡、體重、身高、ALT、AST比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 漢族與維吾爾族肝損傷患者IL-10分泌量 檢測顯示漢族組、維吾爾族組ATDLI患者 IL-10分泌量分別為(45.81±11.04)、(56.30±17.24)pg/mL。維吾爾族組患者高于漢族組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.28，P<0.0001)。

2.3 不同性別的漢族、維吾爾族ATDLI患者IL-10分泌水平 漢族組、維吾爾族組ATDLI患者不同性別的血清IL-10相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別IL-10tP漢族組0.1030.935 男46.99±12.40 女47.28±14.81維吾爾族組0.9390.305 男57.20±18.28 女 54.44±15.47

2.4 漢族、維吾爾族ATDLI患者不同肝損傷程度的IL-10分泌量 按肝損傷嚴(yán)重程度分級標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)ALT值將ATDLI患者分為輕度(ALT值80～120 U/L)、中度(ALT值120～200 U/L)和重度(ALT值>200 U/L)肝損傷三組。漢族組、維吾爾族組ATDLI患者輕度、中度、重度肝損傷構(gòu)成及IL-10分泌量見表2。漢族組、維吾爾族組ATDLI患者不同程度肝損傷構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.137，P=0.208)。

組間兩兩比較顯示，漢族組、維吾爾族組重度肝損傷患者IL-10的分泌量均高于輕度肝損傷患者(均P<0.05)；而中度肝損傷患者與輕度、重度肝損傷患者之間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。兩個民族ATDLI患者隨著肝損傷程度加重，抑炎因子IL-10的分泌量逐漸升高。見圖1。

表2漢族、維吾爾族ATDLI患者輕度、中度、重度肝損傷構(gòu)成及IL-10分泌量

Table2Constituent and secretion level of IL-10 in Han and Uyghur nationality patients with slight, moderate and severe ATDLI

肝損傷程度例(%)IL-10(pg/mL)漢族組 重度10(10.0)49.52±13.21 中度18(18.0)47.39±10.58 輕度72(72.0)44.73±9.10維吾爾族組 重度22(16.3)58.62±14.38 中度30(22.2)56.84±13.71 輕度83(61.5)52.30±15.24

*：漢族輕度組與重度組比較，P<0.05；●：維吾爾族輕度組與重度組比較，P<0.05

3 討論

隨著對細胞因子研究的深入，發(fā)現(xiàn)在肝損傷的發(fā)病機制中，免疫反應(yīng)中的細胞因子發(fā)揮著重要的作用。IL-10的分泌量與結(jié)核免疫力缺乏相關(guān)，其可調(diào)節(jié)促炎癥因子CD4+T輔助細胞反應(yīng)[10-11]。并有文獻顯示IL-10通過多種調(diào)節(jié)機制參與肝纖維化的發(fā)展，在炎癥因子所致的肝纖維化中具抗纖維化作用，結(jié)果表明慢性肝炎患者血清IL-10濃度高于對照組，且不同損傷程度的患者體內(nèi)IL-10濃度重度組高于輕度、中度組，認為IL-10參與肝慢性損傷的病理過程，且隨著反映肝損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)升高而升高[12]。本研究結(jié)果顯示，漢族、維吾爾族ATDLI輕度組患者IL-10分泌量均低于重度組(P<0.05)。并且本課題組前期對254例(漢族132例，維吾爾族122例)肺結(jié)核患者在服用抗結(jié)核藥物治療后，非ATDLI患者血清IL-10表達水平的研究顯示：維吾爾族患者高于漢族[13]。本次對ATDLI患者IL-10分泌水平的研究結(jié)果同樣是維吾爾族患者高于漢族。將本次結(jié)果與前期結(jié)果[13]整合分析發(fā)現(xiàn)：漢族、維吾爾族ATDLI患者IL-10分泌水平均高于結(jié)核病患者(P<0.0001)。反映出IL-10分泌量的增加與藥物性肝損傷的發(fā)生相關(guān)，隨著血清ALT、AST的升高，血清IL-10也伴隨升高。這也與文獻[12]報道的結(jié)果吻合。

IL-10的主要生物學(xué)功能是抑制和終止體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，對所有的促炎性細胞因子從合成到釋放幾乎都有抑制作用，參與多種免疫炎癥的病理過程[14-15]。研究[16]表明IL-10的分泌水平75%是由遺傳決定的，而且主要受轉(zhuǎn)錄水平的控制。本項目前期對漢族(124例)、維吾爾族(131例)健康人群IL-10基因多態(tài)性與分泌量的相關(guān)性研究[17]顯示：IL-10的-1082G/A、-819C/T、-592C/A位點基因型在漢族與維吾爾族人群的總體分布均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)，其中-1082位點的AA型和AG型在兩民族間分布有差異，但AA型更顯著(OR=5.49)，漢族人群AA基因型頻率高于維吾爾族人群(P<0.001)，漢族-819位點TT基因型和-592位點AA基因型頻率的分布高于維吾爾族(P=0.02)；維吾爾族人群-1082位點AG型、-819和-592位點CC基因型頻率的分布高于漢族(P<0.001)。對各位點等位基因進行卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)-1082G/A位點維吾爾族人群等位基因G(25.57%)高于漢族(7.26%)，-819C/T和 -592C/A位點維吾爾族人群等位基因C(50.38%)高于漢族(32.66%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

而 IL-10啟動子區(qū)-1082、-819、-592這三個位點基因多態(tài)性對體內(nèi)IL-10水平的變化會產(chǎn)生影響，研究[18]顯示-1082位點位于Ets轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，該位點G等位基因體內(nèi)IL-10水平傾向于高表達，而A等位基因則傾向于IL-10低水平表達。同樣前期的結(jié)果[17]也證實GCC為高分泌型，ATA為低分泌型，ACC的表達水平介于前兩者之間。維吾爾族-1082位點的AG型、-819位點的CC和CT型、-592位點的CC和CA型血清IL-10濃度高于漢族(P<0.05)。體內(nèi)IL-10的分泌水平主要受遺傳因素的調(diào)控在不同人群間呈現(xiàn)出差異[19-20]。當(dāng)攜帶GCC等位基因型時，IL-10的表達較高；當(dāng)攜帶ATA等位基因型時細胞因子IL-10的表達較低。

新疆靠近中亞，作為古絲綢之路的重要通道，由于遷移、婚配等原因使維吾爾族融合有30%左右的高加索人種血緣[21]。與漢族人群在體質(zhì)和遺傳距離上有明顯不同[22-23]。本文對漢族與維吾爾族ATDLI患者血清IL-10分泌量的研究顯示：維吾爾族患者IL-10的分泌水平高于漢族受試患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示這應(yīng)與兩個民族人群的遺傳基因多態(tài)性相關(guān)。由于受試患者的樣本數(shù)量有限，僅對ATDLI患者IL-10的分泌量進行了探討，其民族間IL-10分泌水平差異的機制尚需更大群體樣本進一步的研究予以證實。

本試驗通過檢測漢族與維吾爾族ATDLI患者體內(nèi)IL-10分泌水平，研究其在肝損傷患者體內(nèi)的變化以及在不同民族間表達水平的差異，將有利于探討細胞因子在結(jié)核病患者體內(nèi)的表達特點，為疾病的診斷、治療及愈后觀察提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。