蔬菜復合可溶性膳食纖維酶法提取及抗氧化活性研究

張博華 ，張明 ，楊立風 ，門慶永 ，陳彩霞 ，王崇隊 ，馬超 *

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014；2.山東恒寶食品集團有限公司，山東日照276500）

膳食纖維是指不易被人體消化吸收的食物營養(yǎng)素，被稱為第七大營養(yǎng)素，包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等。膳食纖維具有多種功效，能增加飽腹感；調(diào)節(jié)血糖平衡，預防糖尿??；調(diào)整腸道菌群，預防便秘和改善心腦血管疾病[1]。根據(jù)其能否在熱水或溫水中溶解，又分為可溶性膳食纖維（Soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性膳食纖維（Insoluble dietary fiber,DF）。對人體起主要功效的是可溶性膳食纖維，包括葡聚糖、果膠、樹膠、藻膠、豆膠、瓊脂和羥甲基纖維素等[2]?？扇苄陨攀忱w維既能溶解于水，又能吸水膨脹，并能被大腸中微生物降解?？扇苄陨攀忱w維可增加飽腹感、降低脂肪的熱比值，避免體內(nèi)脂肪的過度積累，達到控制體重的目的[3]。

目前針對可溶性膳食纖維的提取研究主要集中在單一物料上，復合物料可溶性膳食纖維的提取研究還較少。研究發(fā)現(xiàn)，多種膳食纖維復合作用效果比單一膳食纖維更佳，且復合膳食纖維的組合作用并不是簡單地相加作用，而是存在復雜的協(xié)同關(guān)系。此外，復合可溶性膳食纖維提取對工廠化生產(chǎn)具有積極影響，可減少重復的提取環(huán)節(jié)，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。本研究在前期調(diào)研的基礎上，選取西藍花、苦瓜、魔芋、金針菇四種蔬菜作用原料[4]，采用淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等生物酶制劑進行蔬菜復合可溶性膳食纖維的提取研究，通過正交優(yōu)化試驗確定最佳提取工藝，并對其抗氧化活性進行分析，以期為蔬菜復合可溶性膳食纖維的提取及綜合利用提供指導。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

西藍花、苦瓜、金針菇、魔芋，均購于山東恒寶食品集團有限公司。

α-高溫淀粉酶（40000 U/g）、蛋白酶（50000 U/g）、糖化酶（100000 U/g）、DPPH，美國 Sigma公司。無水乙醇、鹽酸、硝酸銀、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、氯化亞鐵、硫酸鐵、水楊酸、雙氧水等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設備

ME104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；pHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器有限公司；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器，江蘇杰瑞爾電器有限公司；pHP-250A型高速多功能粉碎機，浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DGG-9070B型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；UV1000紫外分光光度計，上海天美科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蔬菜復合可溶性膳食纖維提取工藝流程

原料復配→蒸餾水混勻→高溫淀粉酶90℃酶解→冷卻→蛋白酶45℃酶解→調(diào)整pH→60℃糖化酶酶解→加熱滅酶→離心→取上清液→醇沉→抽濾→干燥→蔬菜復合可溶性膳食纖維。

1.2.2 工藝操作要點

稱取苦瓜、魔芋、西藍花、金針菇四種原粉各1 g，進行復配，加入一定量的蒸餾水混勻并水浴加熱到90℃?zhèn)溆?。在原料液體中加入淀粉酶溶液，90℃酶解一段時間。酶解結(jié)束后冷卻至45℃，并加入蛋白酶進行酶解。待酶解完成立刻調(diào)整pH到4.0～4.5，達到糖化酶的最適pH，同時使蛋白酶滅活。加入糖化酶25 U/g，60℃酶解60 min，之后加熱滅酶。樣品液離心取上清液，用無水乙醇提取可溶性膳食纖維，抽濾烘干得到蔬菜復合可溶性膳食纖維。

1.2.3 單因素試驗

在高溫淀粉酶最適溫度（90℃）與pH（5.5）條件下，分別考察高溫淀粉酶的加入量（50、100、150、200、250 U/g）、酶解時間（20、40、60、80、100 min）；在最適溫度（60℃）最適pH（5.5）條件下，分別考察蛋白酶的加入量（375、750、1125、1500、1875 U/g）、酶解時間（20、40、60、80、100 min）；料液比（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100）對四種蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率的影響。

1.2.4 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，分別選取高溫淀粉酶的添加量、淀粉酶酶解時間、蛋白酶添加量、蛋白酶酶解時間四個因素，以復合可溶性膳食纖維的提取率為測定指標，進行正交試驗[5]。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 可溶性膳食纖維提取得率計算

式中：c為測得復合可溶性膳食纖維濃度，mg/mL；

n為稀釋倍數(shù)；

v為復合可溶性膳食纖維溶液體積，mL；

m為復合原料質(zhì)量，mg。

1.3.2 抗氧化活性的測定

將蔬菜復合可溶性膳食纖維、西藍花可溶性膳食纖維、金針菇可溶性膳食纖維、魔芋可溶性膳食纖維、苦瓜膳食纖分別配置成 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL 的樣品溶液，進行DPPH自由基清除活性、羥自由基清除活性和還原能力的測定。

（1）DPPH自由基清除活性測定

取2 mL的樣品溶液和2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液放入試管中，充分混合后避光靜置30 min，在517 nm處測定其吸光度A1。同法測定2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸餾水的吸光度A0，同時用VC標準品作為對照。

（2）·OH自由基清除活性測定

取不同濃度的可溶性膳食纖維樣品溶1 mL分別加入到試管中，分別依次加入1 mL、8 mmol/L FeSO4溶液，1 mL、8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，1 mL、8 mmol/L H2O2。充分混勻后靜置1 h，在510 nm處測定吸光值A4。同樣方法，用蒸餾水替代樣品測得吸光度A；用蒸餾水替代H2O2測得吸光度A3，同時用VC標準品作為對照[6]。

（3）還原力測定

取不同濃度的可溶性膳食纖維樣品溶液0.5 mL，加入2.5 mL、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6、0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液62.5 mL+0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液37.5 mL）和2.5 mL、1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50℃溫度水浴保溫20 min，然后加入2.5 mL、10%的三氯乙酸溶液、5 mL蒸餾水和1 mL、0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10 min，以無水乙醇代可溶性膳食纖維提取液按上述處理作空白對照，于700 nm波長處測定吸光度[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 淀粉酶添加量對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率的影響

圖1 淀粉酶添加量對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率影響Fig.1 Effect of amylase addition amount on extraction rate of SDF from compound vegetables

圖1（見上頁）顯示了高溫淀粉酶添加量對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率的影響。由圖可知，當高溫淀粉酶的添加量在0～200 U/g之間時，復合可溶性膳食纖維提取率呈現(xiàn)上升趨勢，說明在此加酶量范圍內(nèi)，加酶量越多，溶出的可溶性膳食纖維越多。但是當加酶量高于200 U/g時，復合可溶性膳食纖維提取率曲線變化較小，略有下降。因此，高溫淀粉酶最適的添加量為200 U/g。

2.1.2 蛋白酶添加量對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率的影響

圖2顯示了蛋白酶添加量對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率的影響。由圖可知，當?shù)鞍酌傅奶砑恿吭?～1125 U/g之間時，復合可溶性膳食纖維提取率呈現(xiàn)上升趨勢。說明在此加酶量范圍內(nèi)，加酶量越多，溶出的可溶性膳食纖維越多。但是當加酶量高于1125 U/g時，復合可溶性膳食纖維提取率曲線略有下降。因此，蛋白酶最適添加量為1125 U/g。

圖2 蛋白酶添加量對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率影響Fig.2 Effect of protease addition amount on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.1.3 淀粉酶反應時間對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率的影響

圖3顯示了高溫淀粉酶反應時間對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率的影響。由圖可以得出，當酶處理時間小于60 min時，復合可溶性膳食纖維提取率隨著處理時間的增加而明顯上升；當酶處理時間超過60 min時，復合可溶性膳食纖維提取率變化平穩(wěn)。故淀粉酶酶解的最佳處理時間為60 min。

圖 3 高溫淀粉酶反應時間對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率影響Fig.3 Effect of amylase reaction time on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.1.4 蛋白酶反應時間對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率的影響

圖4顯示了蛋白酶反應時間對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率的影響。由圖可以得出，當?shù)鞍酌傅奶幚頃r間小于60 min時，復合可溶性膳食纖維提取率隨著處理時間的增加而明顯上升；當?shù)鞍酌傅奶幚頃r間超過60 min時，復合可溶性膳食纖維提取率呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢。故蛋白酶酶解的最佳處理時間為60 min。

圖4 蛋白酶反應時間對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率影響Fig.4 Effect of protease reaction time on extraction rate of SDF from compound fruit and vegetable

2.1.5 料液比對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率的影響

根據(jù)圖5可知，料液比對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率隨料液比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當料液比在1:40時達到最高，當料液比過高時蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率開始下降，這可能是因為在料液比1:40時樣品中可溶性膳食纖維已經(jīng)完全溶出。當料液比過大時不利于后期的提取，導致提取率緩慢下降。因此料液比選擇1:40左右為宜。

圖5 料液比對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of SDF from compound vegetables

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎上，發(fā)現(xiàn)淀粉酶添加量、蛋白酶添加量、淀粉酶反應時間、蛋白酶反應時間四個因素對蔬菜復合可溶性膳食纖維的提取率影響較大，因此進行L9(34)正交試驗，各因素水平設計見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗設計Table 1 Orthogonal experimental design

由表2可以看出，各因素對蔬菜復合可溶性膳食纖維提取率的影響大小順序為：B（蛋白酶添加量）＞A（淀粉酶添加量量）＞D（蛋白酶酶解時間）＞C（淀粉酶酶解時間）。復合酶法提取蔬菜復合可溶性膳食纖維的最佳工藝為A2B2C2D2，即淀粉酶添加量200 U/g，蛋白酶添加量1125 U/g，淀粉酶酶解時間60 min，蛋白酶酶解時間60 min。通過進一步驗證，在此條件下，蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率為4.97%，均高于其他試驗組。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal design

2.3 抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，甲醇溶液顯紫色，自由基清除劑能夠與DPPH的單電子配對，在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也會隨之變小，DPPH自由基清除率越高，表明其抗氧化能力越大。由圖6可知，苦瓜、金針菇、魔芋、西藍花與復合可溶性膳食纖維對DPPH自由基的清除能力隨著可溶性膳食纖維質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，在質(zhì)量濃度為3 mg/mL時，復合可溶性膳食纖維清除率最高達到82.42%，高于其它4種單一組分。

2.3.2 對·OH自由基的清除能力

由圖7可知，復合蔬菜可溶性膳食纖維對·OH自由基的清除能力隨著可溶性膳食纖維質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。復合可溶性膳食纖維在質(zhì)量濃度3 mg/mL時清除率最高，可達57.97%，高于西藍花、苦瓜、魔芋、金針菇這4種可溶性膳食纖維的清除率。

2.3.3 還原力

圖8 可溶性膳食纖維總還原能力對比Fig.8 Contrast of total reducing ability of SDF from compound vegetables

由圖8可知，苦瓜、金針菇、魔芋、西藍花與復合可溶性膳食纖維均具有一定的還原能力，并隨著可溶性膳食纖維質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。且在一定濃度范圍內(nèi)，苦瓜、金針菇、魔芋、西藍花四種單一組分的還原能力要高于復合組分，其中金針菇的還原力最強。

3 結(jié)論

通過正交試驗方法優(yōu)化了蔬菜復合膳食纖維的提取工藝，最佳工藝參數(shù)為淀粉酶添加量200 U/g，蛋白酶添加量1125 U/g，淀粉酶酶解時間60 min，蛋白酶酶解時間60 min。在此條件下，蔬菜復合可溶性膳食纖維提取得率為4.97%。

提取所得的蔬菜復合膳食纖維具有一定的抗氧化能力，在質(zhì)量濃度為3 mg/mL時，復合可溶性膳食纖維DPPH自由基清除率、·OH自由基清除率分別為82.42%、57.97%，均高于金針菇、苦瓜、魔芋這3種單一可溶性膳食纖維。蔬菜復合膳食纖維具有一定的還原能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，單一組分的還原能力要高于復合組分。