氧化應(yīng)激與慢性鼻竇炎和鼻息肉發(fā)病的相關(guān)性研究*

吳敏曼 黃春江 施志強(qiáng) 張玲 普合菊

1云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（云南昆明，650021）

我們前期慢性鼻竇炎、鼻息肉和正常鼻黏膜組織間差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了4個與氧化應(yīng)激有關(guān)的蛋白質(zhì)Cu/ZnSOD、DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）在慢性鼻竇炎組織中表達(dá)最高，而在鼻息肉組織中表達(dá)最低[1]。并通過免疫組化實驗觀察Cu/ZnSOD在慢性鼻竇炎和鼻息肉組織中的定位表達(dá)[2]。在本次實驗中，我們打算采用免疫組化實驗并擴(kuò)大標(biāo)本量來觀察DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）在慢性鼻竇炎、鼻息肉和正常鼻黏膜組織之間的表達(dá)情況。以了解氧化應(yīng)激與慢性鼻竇炎和鼻息肉發(fā)病的相關(guān)性。

資料與方法

1 收集病例

收集慢性鼻竇炎鼻息肉臨床病例74例，根據(jù)臨床表現(xiàn)、CT掃描、病理診斷和隨訪觀察情況將病例分為兩組：不伴鼻息肉慢性鼻-鼻竇炎（CRSsNP）38例，伴有鼻息肉慢性鼻-鼻竇炎（CRSwNP）36例。收集正常對照組18例。所有病例均通過醫(yī)院倫理委員會審議。

①納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲，無嚴(yán)重器質(zhì)性疾?。ㄈ缧呐K病、高血壓、糖尿病、腎病和結(jié)締組織?。⒄铡堵员?鼻竇炎診斷和治療指南（2012年，昆明）》選擇病例。術(shù)前2周均未用糖皮質(zhì)激素、抗生素及抗組胺藥。正常對照組鼻黏膜組織取自單純鼻中隔偏曲患者的中鼻甲黏膜。

②排除標(biāo)準(zhǔn)：排除慢性真菌鼻竇炎、鼻腔乳頭狀瘤、急性鼻-鼻竇炎及伴有鼻腔鼻竇惡性腫瘤者、免疫功能缺陷者、原發(fā)性纖毛運動功能障礙和囊性纖維化等疾病。

2 主要實驗試劑及儀器

①SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木素復(fù)染液-北京博奧森生物技術(shù)有限公司；

②兔抗DJ-1蛋白、兔抗谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和兔抗自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）多克隆抗體-北京博奧森生物技術(shù)有限公司；

③Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡-日本產(chǎn)。

3 免疫組織化學(xué)法檢測DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）

取石蠟塊連續(xù)切片，厚度4um，采用免疫組化SP法進(jìn)行（參照說明書進(jìn)行實驗）。

4 圖像分析

切片采用Olympus BX51型顯微鏡在低倍鏡（×200）下觀察，染色強(qiáng)度分級如下：陰性(－)：無陽性細(xì)胞；弱陽性(＋)：陽性細(xì)胞比例≤25%；中等陽性(＋＋)：陽性細(xì)胞比例為 26%～50%；強(qiáng)陽性(＋＋＋)：陽性細(xì)胞比例≥50%。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 15.0統(tǒng)計軟件：多個構(gòu)成比的χ2檢驗統(tǒng)計分析慢性鼻竇炎、鼻息肉和正常鼻黏膜組織之間DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和NKEF-B陽性細(xì)胞構(gòu)成比有無差異。

結(jié)果

1 染色結(jié)果

我們采用免疫組化試驗并擴(kuò)大標(biāo)本量來驗證DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和NKEF-B在慢性鼻竇炎、鼻息肉和正常鼻黏膜組織之間的差異表達(dá)并觀察在組織中的定位情況。發(fā)現(xiàn)DJ-1陽性細(xì)胞是以胞漿或者胞核出現(xiàn)棕黃色染色，主要位于黏膜上皮及腺上皮（圖1A、B、C）。

發(fā)現(xiàn)谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi陽性細(xì)胞是以胞漿或者胞核出現(xiàn)棕黃色染色，主要位于黏膜上皮及腺上皮（圖 2A、B、C）。

發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）陽性細(xì)胞是以胞漿或者胞核出現(xiàn)棕黃色染色，主要位于黏膜上皮及腺上皮（圖3A、B、C）。

2 統(tǒng)計分析結(jié)果

我們發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和NKEF-B在同一個組織標(biāo)本中的定位和表達(dá)強(qiáng)度是一致的。它們主要表達(dá)于黏膜上皮和腺上皮，χ2檢驗統(tǒng)計分析慢性鼻竇炎、鼻息肉和正常鼻黏膜組織之間DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和NKEF-B陽性強(qiáng)度構(gòu)成比是有顯著性差異的（χ2=46.053，P＜0.01)。慢性鼻竇炎組織的陽性強(qiáng)度以“+++”為主（圖1.A和圖2.A和圖3.A)，鼻息肉組織的陽性強(qiáng)度以“+”為主（圖1.B和圖2.B和圖3.B），正常鼻黏膜組織的陽性強(qiáng)度以“++”為主（圖1.C和圖2.C和圖3.C）。慢性鼻竇炎、鼻息肉和正常鼻黏膜組織之間DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和NKEF-B陽性強(qiáng)度的比較，見表1。

表1 慢性鼻竇炎、鼻息肉和正常鼻黏膜組織之間DJ-1蛋白、光胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和NKEF-B陽性強(qiáng)度的比較

討論

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量以氧自由基為主的氧化中間產(chǎn)物，這是導(dǎo)致衰老和疾病的一個重要因素。氧化應(yīng)激和炎癥是緊密相連的[3-6]。Uneri C等[7-10]發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中氧自由基含量較高，因此指出氧自由基損害與鼻息肉的發(fā)病有關(guān)。正常生理條件下，機(jī)體具備完善的抗氧化防御機(jī)制。我們前期慢性鼻竇炎和鼻息肉組織的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了4個抗氧化有關(guān)的蛋白質(zhì)：超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）、DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）在慢性鼻竇炎和鼻息肉組織中差異表達(dá)。并通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)CuZnSOD定位于鼻黏膜上皮、腺上皮和杯狀細(xì)胞中，是鼻黏膜局部抗氧化防御機(jī)制的重要成分。

DJ-1蛋白通過清除活性氧而清除由氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)氧化，用反義DJ-1敲除內(nèi)源性DJ-1基因，可使細(xì)胞易受氧化損傷。DJ-1蛋白通過增加限速酶-谷氨酸半胱氨酸連接酶的活性而增加了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平，減少了由氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)氧化，從而改善細(xì)胞存活[11]。

谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi是一種抗氧化物酶，能抵抗氧化應(yīng)激，并發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)解毒作用。慢性炎癥遷延不愈或反復(fù)發(fā)作與炎性細(xì)胞產(chǎn)生活性氧有關(guān)，活性氧是許多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的第二信使，這些細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞增生、分化和凋亡有關(guān)[12]。谷光苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi可通過清除活性氧而發(fā)揮抗炎作用。

自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）（亦稱Peroxiredoxin 2硫氧還蛋白過氧化物酶Ⅱ）能夠增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性，此外它是一種抗氧化蛋白，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和化學(xué)成分的損傷；能清除新陳代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物[13]。

本次研究中我們觀察到DJ-1蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶-pi和自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子B（NKEF-B）也表達(dá)于鼻黏膜上皮、腺上皮和杯狀細(xì)胞中。它們在慢性鼻竇炎組織中表達(dá)最高，而在鼻息肉組織標(biāo)本中表達(dá)較低，可以推測當(dāng)鼻黏膜抗氧化應(yīng)激能力減弱或先天缺陷，氧自由基清除減少，導(dǎo)致慢性炎癥可能遷延不愈或轉(zhuǎn)化為鼻息肉。因此氧化應(yīng)激損傷與慢性鼻竇炎和鼻息肉發(fā)生、發(fā)展和炎癥遷延密切相關(guān)?？寡趸鞍自诼员歉]炎中的高表達(dá)與鼻息肉中的低表達(dá)恰好從病理生理學(xué)上佐證了臨床上二者雖然常常伴隨發(fā)生，但二者可能是不同疾病或是同一疾病的不同發(fā)展階段。抗氧化蛋白的差異表達(dá)對慢性鼻竇炎及鼻息肉的發(fā)病及預(yù)后有著重要的作用。此外，研究和開發(fā)高效無毒的氧自由基清除劑特別是天然抗氧化劑對于治療慢性鼻竇炎和鼻息肉等炎癥性疾病也具有重要的應(yīng)用價值[14]。