QTL原理和統(tǒng)計(jì)分析方法及其在果樹上的研究進(jìn)展

趙慧

摘 要：本文對(duì)QTL作圖的原理、定位的必要條件及其常用統(tǒng)計(jì)方法做了簡(jiǎn)單介紹，綜述了6種分子標(biāo)記在果樹上的應(yīng)用和近年來國(guó)內(nèi)外在果樹數(shù)量性狀遺傳的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞：果樹，數(shù)量性狀，研究進(jìn)展，QTL，應(yīng)用

果樹的抗逆性 、抗蟲性、抗病性 、產(chǎn)量、果色 、品質(zhì) 、熟期、樹冠等重要農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)為數(shù)量遺傳，控制數(shù)量性狀的基因稱為多基因或微效基因，它們?cè)谌旧w上的位置稱為數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）。

近年來，對(duì)果樹QTL已進(jìn)行了大量的研究，取得了不少成果和進(jìn)展。本文就有關(guān)這方面的研究現(xiàn)狀作一簡(jiǎn)要綜述。

一、QTL定位策略

1.QTL作圖原理及QTL定位的必要條件

QTL作圖是通過分析整個(gè)染色體組的DNA標(biāo)記和數(shù)量性狀表型值的關(guān)系，將QTL逐一定位到連鎖群的相應(yīng)位置，并估計(jì)其遺傳效應(yīng)。一般步驟包括：（1）構(gòu)建遺傳連鎖圖;（2）選擇具有相對(duì)性狀的純系進(jìn)行雜交，獲得適宜的作圖群體;（3）檢測(cè)分離世代群體中每一個(gè)體的標(biāo)記基因型和數(shù)量性狀值;（4）分析標(biāo)記基因型和數(shù)量性狀值的相互關(guān)聯(lián)，確定QTL在染色體上的相對(duì)位置，估計(jì)QTL的有關(guān)遺傳參數(shù)。

2.QTL定位的統(tǒng)計(jì)分析方法

利用分子標(biāo)記正確進(jìn)行QTL定位及其效應(yīng)的估計(jì)，主要依賴于QTL作圖的統(tǒng)計(jì)模型和方法，20世紀(jì)80年代以來，先后發(fā)展了20多種QTL作圖的統(tǒng)計(jì)方法，應(yīng)用比較廣泛的主要有以下幾種：

（1） 單一標(biāo)記分析法。單標(biāo)記分析法就是通過方差分析、回歸分析或似然比檢驗(yàn)，比較不同標(biāo)記基因型數(shù)量性狀均值的差異。如存在顯著差異，則說明控制該數(shù)量性狀的QTL與標(biāo)記有連鎖。

（2）區(qū)間作圖法。區(qū)間作圖法即通過利用相鄰的一對(duì)遺傳標(biāo)記來檢測(cè)該遺傳連鎖區(qū)間與數(shù)量性狀觀測(cè)值之間的相關(guān)是否顯著。該方法已廣泛應(yīng)用于包括植物的遺傳研究中，并曾被認(rèn)為是構(gòu)建QTL圖譜的標(biāo)準(zhǔn)方法。

（3）復(fù)合區(qū)間作圖法。為了克服區(qū)間作圖法的上述缺陷以及能利用多個(gè)遺傳標(biāo)記的信息，Zeng等發(fā)展了復(fù)合區(qū)間作圖法，并將多元回歸分析引入?yún)^(qū)間作圖，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)利用多個(gè)遺傳標(biāo)記信息對(duì)基因組的多個(gè)區(qū)間進(jìn)行多個(gè)QTL的同步檢驗(yàn)。該方法要點(diǎn)是，對(duì)某一特定標(biāo)記區(qū)間進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將與其他QTL連鎖的標(biāo)記也擬合在模型中以控制背景遺傳效應(yīng)。

（4） QTL定位的混合線性模型方法。朱軍等于1999年提出了包括加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)及其與環(huán)境互作效應(yīng)的混合線性模型復(fù)合區(qū)間作圖方法和可以分析包括上位性的各項(xiàng)遺傳主效應(yīng)及其與環(huán)境互作效應(yīng)的QTL作圖方法。該方法把群體均值、QTL的各項(xiàng)遺傳主效應(yīng)（包括加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和上位性效應(yīng)）作為固定效應(yīng)，而把環(huán)境效應(yīng)、QTL與環(huán)境互作效應(yīng)、分子標(biāo)記效應(yīng)及其與環(huán)境的互作效應(yīng)以及殘差作為隨機(jī)效應(yīng)，將效應(yīng)估計(jì)和定位分析結(jié)合起來，進(jìn)行多環(huán)境下的聯(lián)合QTL定位分析，提高了作圖的精度和效率。

二、果樹分子遺傳作圖所利用的分子標(biāo)記

果樹的抗逆性 、抗蟲性、抗病性 、產(chǎn)量、果色 、品質(zhì) 、熟期、樹冠等重要農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)為數(shù)量遺傳。最早證實(shí)遺傳標(biāo)記與 QTL連鎖遺傳關(guān)系的是 Sax， 他用菜豆作試材時(shí)發(fā)現(xiàn)種皮顏色與種子平均大小有密切關(guān)系。要構(gòu)建 QTL圖譜首先必須建立起與QTL相連鎖的分子標(biāo)記，分子標(biāo)記數(shù)目越多并與 QTL連鎖越緊密 ， 就越有可能準(zhǔn)確地估計(jì)QTL的位置。

1.同工酶技術(shù) （isoenzym et echnology）

同工酶標(biāo)記是顯性標(biāo)記，父母本的基因型在后代都可檢測(cè)出來，在遺傳背景不十分清楚的條件下，同工酶標(biāo)記的確不失為一種好的標(biāo)記。果樹植物在遺傳背景不十分清楚的情況下，將同工酶標(biāo)記和其他分子標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行，其準(zhǔn)確性會(huì)提高。

2.RFLP技術(shù) （restrictionfragment lengt hpolymorphism ，RFLP）

基因組 DNA經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶消化后，會(huì)產(chǎn)生大量的 DNA片段，通過 Southern雜交技術(shù)，就可以將與特定探針雜交的DNA片段識(shí)別出來。兩個(gè)親本間的 DNA片段的差異 （多態(tài)性 DNA片段）會(huì)在后代中發(fā)生分離，所以 RFLP獲得的多態(tài)性 DNA片段可用于分子遺傳作圖。RFLP是一種用于分子遺傳作圖較好的共顯性標(biāo)記。Wang等利用 RFLP 技術(shù)構(gòu)建了甜櫻桃 （RSXEB） 的連鎖圖 ， 母本 RS圖譜有 126個(gè) RFLP標(biāo)記 ， 由 19 個(gè)連鎖群組成，總長(zhǎng) 461.6 cm;父本 EB圖譜有 95 個(gè) RFLP標(biāo)記，由 16個(gè)連鎖群組成，總長(zhǎng) 279.2 cm。

3.RAPD技術(shù) （randomamplifiedpolymor phicDNA，R APD）

RAPD技術(shù)是 由美 國(guó)的 Williams和 W elsh。兩 個(gè) 研究小 組 于 1990年 同時(shí) 發(fā)展 起 來 的技 術(shù) ，它 以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，采用 1Obp的寡核苷酸為引物進(jìn)行模板 DNA多態(tài)片段的隨機(jī)擴(kuò)增和檢測(cè) 。由于 RAPD技術(shù)不需要事先獲得模板 DNA序列信息，省略了 RFLP所需的克隆探針制備、同位素操作 和 Southern印跡 雜 交 等 步 驟 ，而 且 所 需DNA樣品量小、設(shè)備及技術(shù)簡(jiǎn)單 、周期短 、擴(kuò)增沒有特異性、合成一套引物可用于不同物種基因組的分析，因而受到研究者的普遍青睞。Hemmat等利用 RAPD并結(jié)合 BSA技術(shù) ， 獲得了與抗蘋果虎皮病 （scab）基因緊密連續(xù)的 RAPD標(biāo)記。西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院利用該技術(shù) ， 成功獲得了分別與抗葡萄 5 種主要真菌病基因連鎖的 RAPD標(biāo)記 8個(gè)。

4.AFLP 技術(shù) （amplificationfragm entlengthpolymor phism，AFLP）

AFIP是 1993年 由荷 蘭 Keygene公 司Zabeau等 發(fā) 明 的一種 DNA 分子 標(biāo)記 技 術(shù)。主要 過 程 是 限 制 性 酶 切 片 段 的 選 擇 性 擴(kuò) 增，AFLP結(jié)合 了 RFLP的穩(wěn)定性和 PCR技術(shù)高效性 的特點(diǎn) ，不 需 Southern雜交 。AFLP多 態(tài)性高，可 檢 測(cè) 5O～ 100甚 至 更 多 的 擴(kuò) 增 片 段。AFLP是一種十分理想有效 的分子標(biāo)記 ，現(xiàn)已應(yīng)用于核果類果樹 的遺傳作 圖、DNA指紋 圖譜鑒定、遺傳多樣性分析 、基因標(biāo)記等許多研究領(lǐng)域。但因試劑盒成本較貴 ， 果樹植物應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行遺傳作圖不多見。

5.SSR 技術(shù) （simplesequencer epeat ，SSR）

SSR 稱為簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列， 或稱為簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性 （shorttandemrepeatpolymorphism，STRP） ， 或稱為微衛(wèi)星序列 （microsatellite）。高等生物的基因組 DNA中 ， 普遍存在 1～6 個(gè)堿基對(duì)組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列， 而且發(fā)現(xiàn)植物中 AT和 CAT是一種較普遍的重復(fù)。

三、QTL在果樹上的研究現(xiàn)狀

目前， 已在核果類果樹分子連鎖圖譜上發(fā)現(xiàn)許多數(shù)量性狀位點(diǎn)，Dirlewanger等利用桃 FefialouJalousia與油桃Fantasia雜交 獲得 的 63株 F2群 體，使用 同工酶、RFLP、RAPD和 AFLP技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)遺傳 圖譜 ，并分析了果實(shí)鮮重、pH值、可滴定酸、糖 （蔗糖、山梨醇 糖、果糖 ）、有機(jī)酸（蘋果酸、檸檬酸、奎尼酸）的QTLs，并發(fā)現(xiàn)它們集中分布在 2個(gè)連鎖群上。

四、展望

對(duì)于果樹育種而言， 驗(yàn)證在某個(gè)雜交組合里發(fā)現(xiàn)的QTLs在不同組合和不同遺傳背景下的穩(wěn)定性是極其重要的，也就是說我們需要發(fā)現(xiàn)那些“通用”的QTLs。 然而由于缺乏合適的標(biāo)記系統(tǒng)，驗(yàn)證不同遺傳背景下QTLs的效應(yīng)在目前構(gòu)建的遺傳圖譜的基礎(chǔ)上很難進(jìn)行。 如果能夠利用QTLs位點(diǎn)本身作為標(biāo)記，即利用控制性狀表達(dá)的基因作為遺傳標(biāo)記，連鎖平衡帶來的問題就會(huì)大大減少， 同時(shí)標(biāo)記輔助選擇的效率也會(huì)得到提高。

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱軍.復(fù)雜數(shù)量性狀基因定位的混合線性模型方法[A].王連錚，戴景瑞（主編）：全國(guó)作物育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C].

基金項(xiàng)目：甜櫻桃新品種創(chuàng)制與節(jié)本提質(zhì)增效技術(shù)研究（2018J12SN081），大連市科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目;甜櫻桃果實(shí)大小相關(guān)基因的篩選與驗(yàn)證（**），大連市青年科技之星項(xiàng)目。