江蘇宿遷地區(qū)Hp感染及糞便基因檢測克拉霉素耐藥現(xiàn)狀

劉偉 王艷 朱季軍 劉云云 王玉欣 王曉燕

摘要：目的? 了解江蘇宿遷地區(qū)幽門螺桿菌（Hp）感染及對克拉霉素的耐藥情況。方法? 收集2016年10月～2017年10月在宿遷市第一人民醫(yī)院行14C呼氣試驗(yàn)檢查的健康體檢者的Hp檢查結(jié)果，隨機(jī)留取412例受檢者的個人資料，并隨機(jī)留取146例Hp感染者的糞便標(biāo)本行糞便基因克拉霉素藥敏試驗(yàn)，統(tǒng)計Hp感染率，比較相關(guān)因素對Hp感染的影響，初步了解Hp克拉霉素耐藥情況。結(jié)果? 共2919例納入研究，1248例Hp陽性（42.75%），男性人群的Hp感染率為44.89%，高于女性的39.89%（P<0.05），20歲以下人群Hp陽性率最低（35.42%），21～40歲人群感染率最高（45.18%），40歲以上人群隨年齡增大感染率有下降趨勢，Hp感染與抽煙、飲酒、個人收入及空腹血糖值之間均無明顯關(guān)系，146例Hp陽性的糞便標(biāo)本中，137例可成功提取細(xì)菌基因組DNA，其中29個樣本的PCR產(chǎn)物經(jīng)BsaⅠ酶切出現(xiàn)兩條目的條帶，所有樣本的PCR產(chǎn)物經(jīng)MboⅡ酶切后均未被切開。結(jié)論? 江蘇宿遷地區(qū)Hp感染率為42.75%，男性人群及年齡在20～40歲感染率高，糞便基因藥敏試驗(yàn)顯示克拉霉素耐藥率高于21.17%，這將為宿遷地區(qū)Hp感染防治提供更有力的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌感染;宿遷地區(qū);糞便基因檢測;克拉霉素耐藥

中圖分類號：R378? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.026

文章編號：1006-1959（2019）02-0091-04

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。流行病學(xué)研究表明，Hp是世界上感染率最高的細(xì)菌之一，尤其在發(fā)展中國家，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。在我國不同地區(qū)，Hp感染率不同，且各年齡階段Hp感染率也不相同，詳細(xì)了解各個地區(qū)Hp感染狀況及易感因素，有助于該地區(qū)Hp感染及相關(guān)疾病的防治[2]。宿遷地區(qū)位于江蘇北部，經(jīng)濟(jì)相對落后，有關(guān)該地區(qū)的Hp感染狀況，尚無相關(guān)研究報道。Hp根除治療方法較多，在中國大陸地區(qū)，含質(zhì)子泵抑制劑（PPI）、克拉霉素、阿莫西林（或甲硝唑）的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法常作為根除一線療法，但隨著Hp對克拉霉素及甲硝唑耐藥率的逐年增加，標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)的根除率在不斷減低[3]。馬斯特里赫特Ⅳ共識意見提出，當(dāng)?shù)貐^(qū)克拉霉素耐藥率達(dá)到15%時，未經(jīng)敏感性檢測的含有PPI+克拉霉素的三聯(lián)根除治療方案應(yīng)當(dāng)被摒棄[4]。因此，了解一個地區(qū)的克拉霉素耐藥情況對于指導(dǎo)Hp的根除治療具有極其重要的意義。本研究中，我們統(tǒng)計了近1年來宿遷地區(qū)體檢行14C呼氣試驗(yàn)人群的Hp感染率和各種相關(guān)危險因素對Hp感染率的影響，并留取部分Hp感染者糞便標(biāo)本行糞便基因克拉霉素耐藥分析，進(jìn)一步了解宿遷地區(qū)Hp感染及克拉霉素耐藥情況，從而為臨床醫(yī)師根除Hp治療提供有力的依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料? 納入人群為2016年10月～2017年10月在宿遷市第一人民醫(yī)院行14C呼氣試驗(yàn)的健康體檢者，所納入者均為宿遷籍長期居住人員，受檢前至少4周未服用抗生素、抑酸藥或鉍劑，排除有胃部手術(shù)史、孕婦及哺乳期婦女，共計2919例納入研究，隨機(jī)留取412例受檢者個人資料，包括性別、年齡、抽煙飲酒情況、收入狀況及空腹血糖值，并隨機(jī)留取146例Hp感染者的糞便標(biāo)本行糞便基因克拉霉素藥敏試驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1 14C呼氣試驗(yàn)檢測方法? 使用安徽養(yǎng)和醫(yī)療器械設(shè)備公司生產(chǎn)的YH04E幽門螺旋桿菌檢測儀和呼氣卡，受檢者至少空腹3 h以上，用溫開水吞服14C-尿素膠囊后，靜坐15 min后向呼氣卡中吹氣留取樣本，卡上指示窗內(nèi)顏色有藍(lán)色變?yōu)榘咨珪r完成取樣，將卡插入檢測儀的進(jìn)樣口，14C-UBT≥100 dpm/mmol CO2時判定為Hp感染。

1.2.2糞便藥敏試驗(yàn)方法? ①糞便細(xì)菌基因組DNA提?。悍Q取180～220 mg凍存糞便標(biāo)本，使用糞便DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按照操作步驟，提取糞便細(xì)菌基因組DNA，并通過Nano-Drop300（杭州奧盛儀器有限公司）檢測DNA濃度及純度，通過測定OD260/OD280比值估計DNA的純度，OD260/OD280>1.8，說明DNA純度較高，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性，凝膠電泳條帶清晰說明無污染。②Hp 23s rRNA基因擴(kuò)增：第一輪擴(kuò)增引物為Hp 23s rRNA1835F：5'-GGTCTCAGCAAAGAGTCCCT-3'，2327R：5'-CCCACCAAGCATTGTCCT-3'，長度為493bp，第二輪擴(kuò)增引物為Hp 23s rRNA 1942F：5'-AGGATGCGTCAGTCGCAAGAT-3'，2308R：5'-CCTGTGGATAACACAGGCCAGT-3'，長度為381bp。PCR反應(yīng)體系包括：2x mix 15μl+MgCl2 1.2μl+上游引物（F）0.8μl+下游引物（R）0.8μl+模板1μl+滅菌H2O 11.2μl，反應(yīng)體系中作為模板的基因組DNA濃度在5 μl/ml左右，引物濃度在10 nM。一輪擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，5個循環(huán)，4℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán)，4℃ 5 min。二輪擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，28個循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取出，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩－傊悄z電泳成像檢測PCR產(chǎn)物。③PCR產(chǎn)物酶切：使用限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性位點(diǎn)的酶切，BsaⅠ酶（2143）識別位點(diǎn)序列：5-GGTCTC（N）1，3-CCAGAG（N）5，酶切產(chǎn)物長度為208bp和173bp。MboⅡ酶（2142）識別位點(diǎn)序列：5-GAAGA（N）8，3-CTTCT9（N）5，酶切產(chǎn)物長度為191bp和190bp。酶切體系成分包括：10xBuffer 1.5μl+BsaⅠ/MboⅡ 0.5μl+PCR產(chǎn)物5μl+ddH2O 8μl，反應(yīng)體系輕輕混勻置于37℃恒溫水浴鍋，孵育過夜，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。④糞便基因組DNA測序驗(yàn)證：所有PCR擴(kuò)增成功的樣本中隨機(jī)選取66個樣本送上海生工測序，測序結(jié)果與酶切結(jié)果相互比較。

1.3觀察指標(biāo)? 統(tǒng)計被納入研究人群總的Hp感染率，包括不同性別、各年齡段、抽煙與否、飲酒與否、不同收入狀態(tài)、不同空腹血糖值的Hp陽性率，并比較以上因素對Hp感染的影響。與克拉霉素耐藥有關(guān)的23s rRNA V區(qū)本身不存在BsaⅠ、MboⅡ的酶切位點(diǎn)，若存在耐藥突變2143位點(diǎn)上A→G突變、2142位點(diǎn)上A→G或A→C突變，則會出現(xiàn)相應(yīng)酶切位點(diǎn)，產(chǎn)物會被酶切成不同的兩條片段，觀察成功提取細(xì)菌基因組DNA標(biāo)本的酶切結(jié)果，初步評估Hp克拉霉素耐藥情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法? 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件處理結(jié)果。計量資料以（x±s）表示，采用方差分析;計數(shù)資料以（%）表示，采用？字2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，影響根除結(jié)果的相關(guān)因素分析采用單因素、多因素回歸分析等方法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1宿遷地區(qū)Hp感染現(xiàn)狀? 2919例健康體檢者行14C呼氣試驗(yàn)檢查，年齡12～81歲，平均年齡（43.79±14.43）歲，Hp感染者共1248例（42.75%），其中男性751例（44.89%），感染率高于女性（？字2=7.300，P=0.007），見表1。

將所有受檢者按年齡分組，分別為12～20歲組、21～40歲組、41～60歲組和60歲以上組，與12～20歲組相比，其余各組感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但Hp感染隨年齡變化存在明顯變化趨勢，其中20歲以下人群感染率較低（35.42%），21～40歲人群感染率最高（45.18%），40歲以上人群隨年齡增大Hp感染率有下降趨勢，見表2。

2.2 Hp感染的相關(guān)因素分析? 將412例接受調(diào)查問卷的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)Hp感染與抽煙、飲酒、個人收入及空腹血糖值之間均無明顯關(guān)系（P>0.05），見表3。

2.3 Hp對克拉霉素耐藥情況? 146例糞便標(biāo)本中有137例細(xì)菌基因組DNA提取正常，Hp 23s RNA第二輪擴(kuò)增結(jié)果見圖1，29例PCR產(chǎn)物經(jīng)BsaⅠ酶切后出現(xiàn)兩條目的條帶，見圖2。137例樣本PCR產(chǎn)物經(jīng)MboⅡ酶切后均未被切開。將137例成功提取DNA的標(biāo)本隨機(jī)抽取66例PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序結(jié)果與酶切結(jié)果一致，見圖3。

3討論

本研究顯示，2016～2017年江蘇宿遷地區(qū)Hp感染率為42.75%，2012～2013年江蘇東臺地區(qū)調(diào)查結(jié)果顯示Hp感染率為44.3%[5]，2013～2014年南京的一項(xiàng)健康人群Hp感染狀況研究表明[6]，南京地區(qū)Hp感染率為43.56%，本地區(qū)Hp感染率與江蘇省其他地區(qū)大致相同?；仡?006年一項(xiàng)江蘇蘇中地區(qū)開展的Hp感染調(diào)查研究[7]，結(jié)果顯示Hp總感染率為62.07%，可見近年來江蘇地區(qū)Hp感染率有大幅下降。結(jié)果顯示男性人群Hp感染率高于女性，這與其他地區(qū)研究結(jié)果一致，2015年“京都全球共識”明確指出Hp感染為一種感染性疾病[8]，通過口-口和糞-口途徑在人與人之間傳播，這可能是男性感染率較高的主要原因。

當(dāng)年齡<20歲，Hp感染率較低，隨著年齡增長，Hp感染率增加，本研究顯示20～40歲人群Hp感染率最高，40歲以上隨著年齡增長Hp感染率趨于穩(wěn)定，并有所下降。李萌輝等統(tǒng)計了天津地區(qū)人群的Hp感染情況[9]，發(fā)現(xiàn)其感染率隨年齡增加呈增加趨勢，50歲以上各年齡組間Hp感染分布無明顯差異，趨于穩(wěn)定。李華等分析了浙江杭州地區(qū)Hp感染情況[10]，不同年齡段感染率統(tǒng)計中，50～59歲及60～69歲年齡組Hp感染率高于其他年齡段，<20歲人群Hp感染率較低。本研究中<20歲及60歲以上年齡組人群較少，無法更深層次體現(xiàn)20歲以下及60歲以上人群的Hp感染趨勢。眾多研究表明，Hp感染與家庭收入、飲食衛(wèi)生、教育程度、家庭聚集、BMI、糖尿病等有關(guān)[11，12]。本研究中，我們分析了Hp感染與收入、抽煙、飲酒及空腹血糖值之間關(guān)系，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），考慮可能與本研究所納入的樣本量相對不足有關(guān)。因此，我們需要更大規(guī)模，年齡分布更平均的流行病學(xué)調(diào)查研究，從而更準(zhǔn)確的反應(yīng)各個年齡段之間Hp感染率的差異及Hp感染與其它因素之間的關(guān)系，給Hp防治提供更準(zhǔn)確的指導(dǎo)。

目前抗菌藥物的廣泛耐藥、Hp菌株毒力改變、CYP2C19基因多態(tài)性及患者依從性差等多種因素，是導(dǎo)致Hp根除治療失敗的主要原因[13]，其中抗生素耐藥是根除率下降的首要因素?，F(xiàn)階段雖然四環(huán)素、呋喃唑酮耐藥率低，但臨床難以獲得，克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星仍然是根除Hp的主要抗生素。Hp 23s rRNA的V區(qū)基因的點(diǎn)突變（最常見的是A2143G，其次為A2142G及A2142C）可以降低克拉霉素的親和力，導(dǎo)致抗生素耐藥，臨床上克拉霉素的耐藥80%～90%是由基因的突變導(dǎo)致的[14]。本研究中我們僅分析了糞便基因組2143及2142位點(diǎn)的突變情況，共收集146例Hp感染者的糞便標(biāo)本，其中137例標(biāo)本糞便基因提取成功，具有較高的成功提取率，137例PCR產(chǎn)物中有29例可被BsaⅠ酶切，而無一例被MboⅡ酶，由此可推斷宿遷地區(qū)糞便基因克拉霉素耐藥率高于21.17%。Masstricht-4共識指出[4]，在克拉霉素耐藥率>15%的地區(qū)，根除Hp的一線方案首先推薦鉍劑四聯(lián)方案，本研究中宿遷地區(qū)克拉霉素耐藥率>20%，因此，在宿遷地區(qū)我們應(yīng)該摒棄標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法，而選擇含鉍劑的四聯(lián)療法作為首選根除方案。在進(jìn)一步的研究中，我們也將根據(jù)糞便基因克拉霉素耐藥結(jié)果指導(dǎo)臨床Hp根除治療。

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收稿日期：2018-9-17;修回日期：2018-9-27

編輯/楊倩