HMGB1在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中的作用及機(jī)制

胡 俊

云南省第二人民醫(yī)院 兒科(昆明 650000)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是全球嬰幼兒和老年人呼吸道感染的主要誘因，其發(fā)生機(jī)制、治療手段尚不清楚。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)是一種核蛋白，在胰腺炎、膿毒癥、腫瘤、風(fēng)濕免疫等疾病中高表達(dá)，并可分泌到細(xì)胞外，發(fā)揮致炎作用[1-4]。Toll樣受體4(toll-like receptor, TLR4)是一種重要的免疫識(shí)別受體，與外界微生物、藥物等相互作用后，激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B, NFκB)，引起下游炎性因子釋放[5-6]。Kaumu等[7-8]發(fā)現(xiàn)HMGB1在腺病毒感染、葡萄球菌感染致肺炎中具有重要作用。但目前HMGB1在合胞病毒感染肺炎中鮮有報(bào)道，且機(jī)制尚不清楚。因此，本研究選取合胞病毒肺炎患兒與健康兒童作比較，明確HMGB1是否通過(guò)參與某條與炎癥相關(guān)的通路發(fā)揮致炎作用，并從細(xì)胞水平確定HMGB1在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年6月至2017年6月在云南省第二人民醫(yī)院就診的46例呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒作為實(shí)驗(yàn)組，其中男23例，女23例，年齡2個(gè)月至2歲。選取同期在本院體檢的正常兒童46例作為對(duì)照組 ，其中男25例，女21例，年齡2個(gè)月至2歲。本文所有臨床操作均獲取知情同意，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組兒童年齡、性別一般資料進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05) (表1)。

表1 研究對(duì)象基線(xiàn)資料比較

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：1)支氣管肺炎患兒：臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、氣促，肺部固定性的中、細(xì)濕啰音，X線(xiàn)檢查，早期見(jiàn)肺紋理增粗，以后出現(xiàn)小斑片狀陰影； 2)呼吸道合胞病毒感染：根據(jù)病毒學(xué)及血清學(xué)進(jìn)行合胞病毒感染的快速診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)： 1)合并有心肝腎等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的患兒； 2)此前就患有肝炎、腎炎等感染疾病或者患有先天性心肺類(lèi)病癥以及有免疫缺陷病癥的患者； 3)患者的體質(zhì)為過(guò)敏性； 4)患者肺部還存在其他病癥。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

采集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組外周靜脈血2 mL于抗凝管，離心分離血漿，置于-80 ℃待測(cè)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法測(cè)定血清中炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP的濃度，實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)美國(guó)eBioscience試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4 流式分析

采集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組外周靜脈血2 mL于抗凝管，淋巴細(xì)胞分離液 (索萊寶)分離單個(gè)核細(xì)胞。經(jīng)固定破膜試劑盒 (美國(guó)Invitrogen公司)使細(xì)胞固定破膜后，用抗TLR4抗體 (英國(guó)Abcam公司)和抗NFκB (英國(guó)Abcam公司)抗體孵育，流式細(xì)胞分析表達(dá)TLR4和NFκB的單個(gè)核細(xì)胞百分比。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

用IP裂解液(thermo fisher scientific)裂解并收集細(xì)胞，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)總蛋白濃度。加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，100 ℃沸水浴10 min后冰上冷卻。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在室溫下用5% 的脫脂奶粉封閉2 h，然后用HMGB1、TLR4、NFκB的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次后，用對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。洗滌3次后，用ECL顯色液 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)顯色，于凝膠成像儀器下曝光和拍照。使用Image J軟件測(cè)定灰度值。

1.6 人支氣管上皮細(xì)胞NHBE的培養(yǎng)、RSV的培養(yǎng)和RSV感染

人支氣管上皮細(xì)胞NHBE的培養(yǎng)：NHBE細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，是一株貼壁細(xì)胞，使用10%胎牛血清 (美國(guó)Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。RSV的培養(yǎng)：將濾菌處理的RSV接種至培養(yǎng)好的Hep-2細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，吸附2 h后于無(wú)血清DMEM中加入3%的胎牛血清培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待80%細(xì)胞出現(xiàn)特征性病變時(shí)，收集病毒并測(cè)定滴度，將滴度稀釋至8～9 log10 PFU/mL，保存于-80 ℃。RSV感染：將NHBE細(xì)胞接種于48孔細(xì)胞板中，待培養(yǎng)孔中細(xì)胞長(zhǎng)至80%滿(mǎn)時(shí)，接種0.1 mL RSV 病毒，吸附1 h后，于無(wú)血清DMEM中加入3%的胎牛血清培養(yǎng)。

1.7 shRNA及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)HMGB1的核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成HMGB1 shRNA序列(shHMGB1)和無(wú)義序列 (Scramble)，序列合成于上海生工生物工程股份有限公司，構(gòu)建于pLKO.1質(zhì)粒上。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h前，接種5×105個(gè)細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染30 min前換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。將200 μL 無(wú)血清DMEM、3 μg質(zhì)粒、9 μL ViaFect Transfection Reagent (美國(guó)Promega)混合，即轉(zhuǎn)染液，室溫靜置10 min。將轉(zhuǎn)染液加入至6孔板中，輕輕混勻后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)9 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束后換用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后，Scramble和shHMGB1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞即為無(wú)義序列組和HMGB1干擾組(表2)。

表2 shRNA序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童血清中炎性因子含量的比較

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組外周血中IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP表達(dá)明顯較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)(表3、圖1)。

表3 兩組兒童血清中炎性因子含量的比較

圖1ELISA檢測(cè)兩組兒童外周血中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP的濃度

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.2 兩組兒童血清中HMGB1含量的比較

LISA檢測(cè)兩組兒童血清中HMGB1的濃度，結(jié)果顯示試驗(yàn)組兒童外周血分泌的HMGB1 (55.75±4.23 pg/mL)明顯高于對(duì)照組兒童外周血分泌的HMGB1 (15.06±5.68 pg/mL)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)(表3、圖2)。

圖2ELISA檢測(cè)兩組兒童血清中HMGB1的濃度
注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.3 兩組兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4和NFκB的表達(dá)比較

在合胞病毒支氣管肺炎患兒外周血中有25%的單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)TLR4，是健康兒童組的5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3A)。在合胞病毒支氣管肺炎患兒外周血中有80%的單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)NFκB，是健康兒童組的4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3B)。

圖3 流式細(xì)胞分析兩組兒童外周血中表達(dá)TLR4和NFκB的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量

注：A：TLR4陽(yáng)性單個(gè)核細(xì)胞占血漿總細(xì)胞百分比，與對(duì)照組相比，**P<0.01；B：NFκB陽(yáng)性單個(gè)核細(xì)胞占血漿總細(xì)胞百分比，與對(duì)照組相比，**P<0.01

2.4 HMGB1 shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)合胞病毒誘導(dǎo)NHBE細(xì)胞TLR4和NFκB表達(dá)的影響

與合胞病毒感染的無(wú)義序列轉(zhuǎn)染組比較，合胞病毒感染的HMGB1干擾組TLR4 (t=17.62,P<0.01)和NFκB (t=14.88,P<0.01)表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A～D)。

圖4 HMGB1干擾組在合胞病毒感染后TLR4和NFκB的表達(dá)

注： A：Western blot檢測(cè)TLR4的表達(dá); B：Western blot檢測(cè)NFκB的表達(dá); C： 灰度分析TLR4的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比較，**P<0.01; D：灰度分析NFκB的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比較，**P<0.01

2.5 合胞病毒誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞分泌HMGB1和表達(dá)TLR4、NFκB

與未用合胞病毒處理的NHBE相比較，合胞病毒感染的NHBE分泌的炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP和HMGB1較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4、圖5A～B)。同時(shí)與未用合胞病毒感染的NHBE相比較，合胞病毒感染的NHBE的 TLR4(t=26.10,P<0.01)和NFκB(t=27.23,P<0.01)表達(dá)較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5C～F)。

表4 兩組兒童血清中炎性因子含量的比較

圖5RSV支氣管上皮細(xì)胞NHBE感染合胞病毒后HMGB1和炎性因子的分泌以及TLR4、NFκB的表達(dá)

注：A：細(xì)胞培養(yǎng)上清炎性因子的濃度，與對(duì)照組相比較，**P<0.01，*P<0.05；B：細(xì)胞培養(yǎng)上清HMGB1的濃度，與對(duì)照組相比較，**P<0.01；C：Western blot檢測(cè)TLR4的表達(dá)；D：Western blot檢測(cè)NFκB的表達(dá)；E：灰度分析TLR4的表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，**P<0.01；F：灰度分析NFκB的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比較，**P<0.01

3 討論

小兒氣道發(fā)育不完全，免疫能力較弱，易受細(xì)菌、病毒的感染，誘發(fā)肺炎疾病發(fā)生[9-10]。 RSV 為引起小兒支氣管肺炎常見(jiàn)的病原微生物之一，屬RNA病毒，可促使Th1/Th2失衡，刺激TNF-α、IL-18等炎性因子的分泌，加重炎癥病情，甚至發(fā)展成呼吸循環(huán)衰竭，導(dǎo)致小兒死亡[10]。

HMGB1是典型的位于細(xì)胞核中的25 kDa DNA結(jié)合蛋白，但在翻譯后修飾(如乙?；?、磷酸化和甲基化)之后，它可以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，待細(xì)胞活化或死亡后被釋放到細(xì)胞外[11-12]。HMGB1最初被表征為轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子，但后來(lái)研究[13-15]發(fā)現(xiàn)HMGB1在許多炎癥性疾病中扮演著細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑的角色。在各種RNA病毒 (包括流感病毒H5N1、丙型肝炎病毒、西尼羅病毒、登革病毒和HIV-1)[16-17]和DNA病毒(如單純皰疹病毒2型)[18]的發(fā)病機(jī)制中，HMGB1的釋放發(fā)揮了重要的作用。目前關(guān)于HMGB1在合胞病毒支氣管肺炎中研究很少，且機(jī)制尚不明確。最近關(guān)于HMGB1在哮喘和COPD的研究[19-21]發(fā)現(xiàn)HMGB1參與了肺部炎癥的發(fā)展過(guò)程，為本研究提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。本研究從生物個(gè)體和細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)，RSV感染誘導(dǎo)HMGB1蛋白從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，并誘導(dǎo)其分泌到胞外環(huán)境。并且，RSV感染誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞導(dǎo)致HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)易位并隨后分泌到細(xì)胞外的過(guò)程是獨(dú)立于細(xì)胞死亡而發(fā)生的。這是因?yàn)楸狙芯吭诓《靖腥镜?4 h內(nèi)沒(méi)有看到任何明顯增加細(xì)胞凋亡、壞死或細(xì)胞病變的現(xiàn)象發(fā)生。

盡管本研究初步探討了HMGB1在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中的作用及機(jī)制，但是仍然有許多不足之處：1)本研究采集了合胞病毒支氣管肺炎患兒的外周血，并對(duì)其中的HMGB1、TLR4/NFκB、炎性因子的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。但炎癥反應(yīng)的發(fā)生是炎性因子和機(jī)體免疫對(duì)抗的過(guò)程，本研究只涉及了炎性因子的分泌情況，忽略了免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和變化的研究；2)本研究只在一株支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行機(jī)制研究，缺乏普遍性；3)本文僅將HMGB進(jìn)行干擾以研究后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)，而干擾TLR4、NFκB又能否達(dá)到相同的效應(yīng)，以及干擾HMGB1再過(guò)表達(dá)TLR4是否會(huì)恢復(fù)下游蛋白的表達(dá)；4)本文僅在體外細(xì)胞水平探討TLR4/NFκB信號(hào)通路的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性均不如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此仍然需要進(jìn)一步構(gòu)建體內(nèi)動(dòng)物模型以驗(yàn)證結(jié)論。

綜上所述，在本研究中，本研究通過(guò)生物個(gè)體即合胞病毒支氣管肺炎患兒的外周血樣品發(fā)現(xiàn)HMGB1、TLR4/NFκB、炎性因子的正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步從細(xì)胞層面證明了合胞病毒感染可同時(shí)促進(jìn)HMGB1、TLR4/NFκB、炎性因子的表達(dá)與分泌。因此我們推測(cè)HMGB1很可能參與了TLR4/NFκB致炎信號(hào)通路，促使炎性因子的分泌增加。合胞病毒感染HMGB1干擾細(xì)胞株結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合胞病毒感染不再誘導(dǎo)TLR4/NFκB的表達(dá)和炎性因子的分泌。綜上所述，HMGB1及其介導(dǎo)的TLR4/NFκB信號(hào)通路在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中高表達(dá)，特異性阻斷HMGB1可抑制TLR4/NFκB信號(hào)通路，緩解呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞分泌炎性因子。