泡球蚴福爾馬林固定標(biāo)本的分子生物學(xué)鑒定方法*

王辰祎，劉巧鳳，張亞樓，黃 燕，陳 凡，王 昕，Δ

1.成都醫(yī)學(xué)院 研究生院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；3.新疆醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(新疆830000)；4.四川省疾病預(yù)防控制中心 寄生蟲病所(成都 610500)

多房包蟲病又稱為泡球蚴病，是一種嚴(yán)重的人畜共患疾病，是人體感染多房棘球絳蟲的中絳期幼蟲-泡球蚴或稱多房棘球蚴所致的寄生蟲病。幼蟲寄生部位主要是肝，其他部位也可受罹。此病預(yù)后極差，應(yīng)該引起人們高度重視。

福爾馬林是一種防腐劑，對大多數(shù)生物標(biāo)本的形態(tài)有著良好的保持作用，對維持組織細(xì)胞完整性方面優(yōu)于其他固定液，故被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)本的長期保存[1]。目前大多數(shù)醫(yī)院及科研機(jī)構(gòu)多用福爾馬林來固定組織標(biāo)本，其標(biāo)本常用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和大病例回顧性研究等方面[2]。然而福爾馬林的交聯(lián)作用可導(dǎo)致標(biāo)本提取的DNA質(zhì)量下降,從而使PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的生成及后續(xù)生物學(xué)分析變得困難[3]。因此，病理研究中采用福爾馬林固定的包蟲標(biāo)本很難用于分子生物學(xué)研究，造成了福爾馬林固定的包蟲標(biāo)本使用局限和浪費(fèi)。一般來說，若要同時(shí)進(jìn)行形態(tài)和分子生物研究，需要在保存階段對同一標(biāo)本進(jìn)行福爾馬林和乙醇兩種固定液的同時(shí)保存，這在實(shí)際工作中過程較為繁瑣。為解決這個(gè)問題，本研究對福爾馬林浸泡標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)方面的應(yīng)用探索，提取到了特異性泡球蚴DNA片段，并對該DNA片段進(jìn)行了分子生物學(xué)分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 蟲體組織和固定液

兩只Wistar大鼠體內(nèi)腹腔接種傳了17代的泡球蚴組織，收集其泡球蚴組織，并將其分別浸泡在10%甲醛溶液(福爾馬林溶液)和100%酒精溶液中。第1只大鼠所提取的泡球蚴組織在兩種溶液中浸泡時(shí)間為6個(gè)月，第2只大鼠的泡球蚴組織浸泡時(shí)間為12個(gè)月。從6個(gè)月福爾馬林和酒精固定液中分別選取樣本25例和8例，從12個(gè)月福爾馬林和酒精固定液中分別選取樣本18例和8例。

1.2 主要試劑、儀器

1.2.1 材料 石蠟包埋組織DNA提取試劑盒，TIANamp FFPE DNAKit(離心柱型)，DP331(天根生化科技有限公司)；2000DNA Maker(Hunan innovagene biotechnology)；Goldview(西安赫特生物公司)；Proteinase K(Tritirachium album corporation)；GoTaq Green Master Mix M7123(Promega corporation)。

1.2.2 儀器 恒溫金屬浴，杭州博日科技有限公司，HB-202型；PCR擴(kuò)增儀，Bio-Rad公司，T100型；離心機(jī)，Thermo公司，LEGENT MICRO 17型；chemiDoc化學(xué)發(fā)光凝膠成像檢測儀，Bio-Rad公司，Universal HoodⅡ型；PowerPac電泳儀，Bio-Rad公司，Universal型；KD-BMⅡ電腦生物組織包埋機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；石蠟切片機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司，RM2235cwEU型；顯微圖像采集系統(tǒng)，Nikon公司，ECLIPSE 55imicroscop。

1.3 方法

1.3.1 泡球蚴組織的制備 麻醉處死感染泡球蚴10個(gè)月的1只雌性Wistar大鼠(第17次傳代)，75%乙醇溶液浸泡15 min。無菌條件下開腹，收集腹腔中泡球蚴囊泡組織若干[4]，分別浸泡置10%甲醛溶液和100%酒精溶液中6個(gè)月。相同的方法，收集另1只感染泡球蚴10個(gè)月的雌性Wistar大鼠(第17次傳代)腹腔中的泡球蚴組織，分別浸泡在以上兩種溶液中12個(gè)月。取上述方法所固定的福爾馬林泡球蚴標(biāo)本，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋，制備成石蠟組織塊，切片后，HE染色，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 泡球蚴固定標(biāo)本DNA的提取 福爾馬林固定液中取出不同的泡球蚴囊泡組織，用剪刀剪碎，從中取約30 mg樣本，置于2 mL離心管中。以同樣方法，從酒精固定液中取出泡球蚴組織樣本作為陽性對照，并以老鼠新鮮肝組織的提取物作為陰性對照。加入現(xiàn)配的PBS緩沖液1 500 mL，漩渦震蕩10 s，10 000 r/min(9 600×g)，離心半徑8.6 cm，離心2 min，棄去上清(不要吸出任何沉淀)，重復(fù)3次。每管加入200 mL GA溶液和20 μL蛋白酶K(均由TIANamp FFPE DNA Kit提供)，充分漩渦震蕩混勻10 s，置于恒溫金屬浴中，56 ℃孵育數(shù)小時(shí)或過夜，直至觀察到樣本完全裂解，消化液中無組織殘?jiān)鼮橐薣5]。再置于恒溫金屬浴中，90 ℃孵育1 h，之后步驟按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 DNA擴(kuò)增，基因序列分析及蟲種鑒定 將提取的 DNA 基因組，擴(kuò)增多房棘球絳蟲的線粒體 12S rRNA 特異目的 DNA 片段, 進(jìn)行 PCR鑒定。反應(yīng)總體積為 25 μL ，其中包含12 μL Go Taq Green Master Mix，9 μL無菌去離子水，2 μL DNA樣本，用于檢測多房棘球絳蟲的上游引物EmH15:5'-CCATATTACAACAATATTCCTATC-3'和下游引物EmH17:5'-GTGAGTGATTCTTG TTAGGGGAAG-3'各1 μL，目標(biāo)片段大小為200 bp。熱循環(huán)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[6-7]。對PCR產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行核酸序列測定 (成都擎科生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，所得結(jié)果在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中 (http:/ /www. Ncbi.nlm. nih. gov)BLAST程序進(jìn)行同源性比較及蟲種遺傳分類分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

多房棘球絳蟲的幼蟲稱泡球蚴，由無數(shù)圓形或橢圓形大小囊泡相互聚集而成，為淡黃色或白色的囊泡狀團(tuán)塊，囊泡外壁為角皮層，整個(gè)泡球蚴與周圍組織間無纖維組織被膜分隔。泡球蚴多以外生性出芽生殖不斷產(chǎn)生新囊泡，長入組織，少數(shù)也可向內(nèi)芽生形成隔膜而分離出新囊泡[8]。經(jīng)過肉眼觀察，腹腔接種泡球蚴的Wistar大鼠10個(gè)月后體內(nèi)器官幾乎全部被大小囊泡占據(jù)(圖1)。在Wistar大鼠體內(nèi)泡球蚴結(jié)構(gòu)為無數(shù)透明、半透明或白色囊泡，囊泡直徑大小不等，小的為1～3 mm，大的為1 cm以上，厚度0.4～1 cm。在呈葡萄狀的囊泡群中也可出現(xiàn)不典型的孤立囊泡結(jié)構(gòu)(圖2A～2B)。一些囊泡內(nèi)含較多囊液和原頭蚴(圖2C)，也有一些囊泡質(zhì)地較硬，含大量干酪樣物而無透明囊液(圖2D)。把實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制備成石蠟組織塊，切片后HE染色，鏡下觀察可見，泡球蚴角皮層呈薄而無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的條帶狀，有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生發(fā)層附著在角皮層上，囊內(nèi)含有原頭蚴，原頭蚴中可見頂突和吸盤，還有數(shù)個(gè)成排排列的小鉤結(jié)構(gòu)，在活躍的泡球蚴中，還可以看到豐富的生發(fā)層和鈣顆粒(圖3A)。不活躍的蟲體組織中，含有少量的細(xì)胞和生發(fā)層，也沒有原頭蚴結(jié)構(gòu)(圖3B)。不同部位取樣后，分別在顯微鏡下觀察泡球蚴的角皮層、生發(fā)層及原頭蚴的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖1 多房棘球蚴在腹腔接種傳了17代的Wistar大鼠

圖2 大鼠體內(nèi)泡球蚴

注：A：囊泡聚集的典型葡萄狀組織肉眼觀；B：孤立的單個(gè)囊泡肉眼觀；C：含有豐富囊液的組織；D：干酪樣的硬結(jié)樣囊泡

圖3 泡球蚴病理切片

注：A：高倍鏡下泡球蚴結(jié)構(gòu)，蟲體很活躍，可見豐富的生發(fā)層、原頭蚴組織和藍(lán)色鈣顆粒；B：泡球蚴組織，其蟲體不活躍，細(xì)胞少，生發(fā)層少，無原頭蚴組織

2.2 多房棘球絳蟲EmH15/17基因的擴(kuò)增及鑒定

泡球蚴線粒體基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖(圖4)。引物擴(kuò)增效果良好，在預(yù)期的200 bp位置出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶，無非特異條帶出現(xiàn)。結(jié)果與GenBank中編號為AB031351多房棘球絳蟲基因具有完全一致的同源性(圖5)。實(shí)驗(yàn)表明，在福爾馬林25例浸泡6個(gè)月和18例浸泡12個(gè)月的泡球蚴標(biāo)本中，均可擴(kuò)增出特異性條帶，其陽性率為100%，且用酒精作為陽性對照時(shí)，同樣條件下擴(kuò)增后，陽性率也為100%，電泳顯示條帶亮度無明顯差異。以鼠肝臟組織作為DNA模板未能擴(kuò)增出特異性條帶。

圖4 EmH15/17基因的擴(kuò)增

注：M：DNAmarker；1：在福爾馬林固定液中浸泡6個(gè)月的泡球蚴組織；2：在酒精固定溶液中浸泡6個(gè)月的泡球蚴組織；3：在福爾馬林固定液中浸泡12個(gè)月的泡球蚴組織；4：在酒精固定溶液中浸泡12個(gè)月的泡球蚴組織；5：新鮮的老鼠肝組織，陰性對照；6：沒有加入DNA樣本的陰性對照

圖5 GenBank中編號為AB031351的多房棘球絳蟲基因序列

3 討論

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，近年來有關(guān)包蟲分子生物鑒定的報(bào)道很多。本研究首次針對福爾馬林固定液中的鼠來源的泡球蚴組織為DNA模板，克服了其提取和鑒定過程中的困難。從多次實(shí)驗(yàn)研究來看，泡球蚴福爾馬林固定標(biāo)本進(jìn)行蟲種鑒定有以下特點(diǎn)。

3.1 福爾馬林固定液的浸泡時(shí)間

雖然福爾馬林對保持生物標(biāo)本的形態(tài)和組織細(xì)胞完整性等方面優(yōu)于其他固定液，但可導(dǎo)致DNA鏈脆性增加，使DNA之間交聯(lián)后形成復(fù)合物。Legrand等[9]對福爾馬林溶液浸泡組織標(biāo)本的影響研究表明, 固定16 d 可成功獲取250 bp 左右的DNA片段, 固定32 d則只能獲取100 bp 左右的DNA片段[10]。本研究采用福爾馬林溶液浸泡6個(gè)月和12個(gè)月的泡球蚴組織標(biāo)本，按所述提取方法，仍取得了很好結(jié)果。

3.2 泡球蚴組織的選取

經(jīng)過觀察，即使嚙齒類動(dòng)物大鼠為多房棘球絳蟲的適宜宿主，其體內(nèi)生長形態(tài)仍有差異，可觀察到典型的呈葡萄狀囊泡群，也可呈單個(gè)囊泡狀，可觀察到含有囊液和原頭蚴的組織，也有干酪樣而無原頭蚴的硬結(jié)樣囊泡，僅通過形態(tài)學(xué)特性進(jìn)行鑒別有一定的難度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不用經(jīng)特殊挑選和處理，這些形態(tài)結(jié)構(gòu)不同的樣本均可經(jīng)DNA提取擴(kuò)增出目的條帶。

3.3 DNA的提取過程

在DNA提取的消化過程中，試劑盒說明書要求將組織樣本在56 ℃孵育1 h，但結(jié)果顯示，1 h不能將組織樣本消化完全，會影響后續(xù)的離心柱提取操作，實(shí)驗(yàn)表明，適當(dāng)延長消化時(shí)間對于DNA提取是有好處的[11]，當(dāng)肉眼觀察到離心管中樣本完全裂解，呈無組織殘?jiān)臒o色或淡黃色澄清液為宜。含有大量囊液的組織樣本易消化，一般加入前述試劑盒中的20 mg，20 μL/mg的蛋白酶K消化6～8 h即可使組織消化完全，而干酪樣的硬結(jié)樣囊泡不易剪碎，且需更長消化時(shí)間。對于難以消化的組織，可采用自購的蛋白酶K將濃度調(diào)至30 μL/mg，縮短消化時(shí)間，直至樣本完全裂解。

本研究嘗試用傳統(tǒng)的蛋白酶K消化酚氯仿抽提法和蛋白酶K消化氯化鈉鹽析法對標(biāo)本進(jìn)行提取，只能提出部分樣本DNA，其凝膠電泳成像檢出率結(jié)果遠(yuǎn)不如前述的方法，可能與樣本組織來源不同有關(guān)。在研究福爾馬林固定的泡球蚴標(biāo)本時(shí)，本研究選取試劑盒離心柱型的方法。

3.4 PCR的擴(kuò)增

在本研究的前期實(shí)驗(yàn)中也使用了傳統(tǒng)的多房棘球絳蟲線粒體擴(kuò)增引物COX1和NAD1[12-13]。COX1(mtDNA)上游引物為5'-AGAGAAAAT TGTGGAGTTACTGCT-3'，下游引物為5'-ATTA CTAATCAACTTAGACTTACA-3'(目的片段為1 793bp)；NAD1 (mtDNA)上游引物為5'-TAG TTTAATTAGAATGTCGGTTTG-3'，下游引物為5'-TCTTGAAGTTAACAGC ATCACGA-3'(目的片段1 013 bp)，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。結(jié)果表明，同一種固定液中浸泡6個(gè)月和12個(gè)月的樣本陽性率無明顯差別，福爾馬林固定液中有25%樣本被擴(kuò)增出目的條帶，酒精固定液中43%的樣本能夠被擴(kuò)增。為了提高實(shí)驗(yàn)的陽性率和引物的靈敏性，考慮運(yùn)用巢式PCR，分別以COX1和NAD1為內(nèi)引物，在Primer 5中設(shè)計(jì)了兩對外引物。第1對外引物COX1(mtDNA)：上游引物5'-AGTGGTGTAGTTC TTATGAGTG-3'和下游引物5'-ACCTAAACA ACCAACTTCACA-3'(目的片段為2 090 bp)；NAD1(mtDNA)：上游引物5'-AATTGGGT TGAGTAGGTGTT-3'和下游引物AAAGTAAGC ATAACCGACCAT-3'(目的片段為1 226 bp)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，進(jìn)行巢式擴(kuò)增后，電泳結(jié)果顯示大量樣本出現(xiàn)涂抹狀條帶，26%的福爾馬林固定樣本可見特異性條帶，在酒精樣本中，陽性率約為47%。第2對外引物COX1(mtDNA)：上游引物5'-AGGGCTG CATGGCAGGTTACT-3'和下游引物5'-CCGTTA AGCATGATGCAAAAGGCAA-3'(目的片段為2 351 bp)；NAD1 (mtDNA)：上游引物5'-TCGTC TGTTGCTACATTGGTTGT-3'和下游引物5'-ACCTGCCATGCAGCCCTATT-3'(目的片段為1 639 bp)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，65 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，進(jìn)行巢式擴(kuò)增后，電泳結(jié)果顯示仍見涂抹狀條帶，兩種固定液中陽性率均約為10%。嘗試逐漸提高退火溫度或降低循環(huán)次數(shù)等方法，結(jié)果由涂抹狀條帶逐漸變淡直至無任何擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)過程中也使用了另一種多房棘球絳蟲的擴(kuò)增引物ND1(目的片段分別為731 bp和631 bp)[14]，電泳結(jié)果表明福爾馬林固定液中泡球蚴樣本在目的條帶731 bp和631 bp的陽性率分別為14%和26%。

在本研究中，多房棘球絳蟲的特異性引物EmH15/17基因的擴(kuò)增得到了100%陽性率，分析以上擴(kuò)增結(jié)果，不能把原因全部歸結(jié)于福爾馬林對DNA的破壞，因?yàn)樵诰凭潭ㄒ褐?，仍有大量樣本不能被擴(kuò)增出來。也可以排除DNA提取量不足的原因，推測可能因?yàn)槟康钠屋^大，使得樣本DNA不能被擴(kuò)增，因此最終選取EmH15/17作為擴(kuò)增引物。這種分子生物學(xué)的鑒定方法，可用于病理學(xué)科中包蟲福爾馬林固定標(biāo)本，進(jìn)行蟲種鑒定和回顧性研究。該方法能從福爾馬林固定的泡球蚴標(biāo)本中，提取到特異性的DNA片段，對于分子生物學(xué)分類鑒定工作十分理想。在后續(xù)研究中，會嘗試用上面的方法對臨床中福爾馬林溶液甚至是石蠟固定的人體標(biāo)本進(jìn)行鑒定和研究。這種泡球蚴福爾馬林固定標(biāo)本的分子生物學(xué)鑒定方法在今后臨床診斷中具有一定價(jià)值和廣泛應(yīng)用前景。