脂多糖缺失所致多黏菌素耐藥的鮑曼不動桿菌研究進展

卞星晨 劉笑芬 張菁,* 陳代杰

(1 上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；2 復旦大學附屬華山醫(yī)院 抗生素研究所，上海 200040；3 上海交通大學藥學院，上海 200240)

鮑曼不動桿菌是全球院內(nèi)感染的重要致病菌[1-2]，可引起醫(yī)院獲得性肺炎、血流感染、尿路感染和傷口感染等各種感染性疾病[3]。隨著抗生素的大量和不恰當?shù)氖褂?，鮑曼不動桿菌對抗生素耐藥的情況日漸突出，在一些國家，對常用藥物如碳青霉烯的耐藥率已高達70%[4]。因缺乏新的有效的治療藥物，臨床上開始使用“古老的”抗生素多黏菌素B和黏菌素(多黏菌素E)治療廣泛耐藥鮑曼不動桿菌所致的各種感染[5]。然而，多黏菌素使用出現(xiàn)的耐藥性問題在歐洲、亞洲、美洲、非洲多個國家均有報道[6-9]。已報道的鮑曼不動桿菌耐藥機制主要有由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)缺失以及LPS修飾所致[10]。本文將簡要綜述脂多糖缺失所致多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌的有關研究進展。

多黏菌素有A、B、C、D和E共5種。目前只有多黏菌素B和E被批準上市。多黏菌素為帶正電的陽離子、含三肽側(cè)鏈的環(huán)狀七肽，環(huán)肽與側(cè)鏈通過α氨基相連接[11](圖1為多黏菌素B和E的結構[12-13])。

多黏菌素對革蘭陰性菌具有強大的抗菌活性，其主要作用于革蘭陰性菌的細胞膜而發(fā)揮抗菌作用。革蘭陰性菌的外膜由脂多糖LPS層和磷脂層組成，帶正電的多黏菌素與LPS層中脂質(zhì)A上帶負電的磷酸基團發(fā)生靜電吸引，與磷酸酯鍵相互結合，置換了膜上具有橋連穩(wěn)定作用的二價陽離子，如鈣離子和鎂離子，然后多黏菌素疏水基團N端脂肪酸部分插入其中，細胞膜穩(wěn)定性遭破壞，細胞內(nèi)成分丟失，細菌死亡[14-15]。

革蘭陰性菌的外膜是非對稱雙分子層；LPS為外層，包含成分有脂質(zhì)A、核心多糖和O-特異側(cè)鏈；磷脂層為內(nèi)層，其間鑲嵌有多種脂蛋白、孔蛋白、外膜蛋白[16]。脂質(zhì)A以β-1',6相連的氨基兩個葡萄糖為骨架，2,3,2',3'位置被(R)3-羥十四酸殘基?；?，與非還原糖連接的脂肪酸又在羥基上進一步?；?，產(chǎn)生?；人岬慕Y構。另外，二糖結構末端1和4'位被磷酸化，帶負電(圖2)[17]。

1 LPS缺失鮑曼不動桿菌對多黏菌素的耐藥機制

鮑曼不動桿菌脂多糖的結構修飾，是報道較多的一種對多黏菌素的耐藥機制。該耐藥機制主要是由于pmrB基因發(fā)生點突變，pmrAB基因表達水平上調(diào)，磷酸乙醇胺(PEtN)轉(zhuǎn)移相關基因pmrC高表達。PEtN對脂質(zhì)A的N-乙酰葡糖胺的4'位進行修飾，使外膜負電荷降低，與黏菌素親和力降低而產(chǎn)生耐藥[17-19]。另外，脂質(zhì)A的糖苷化(己糖胺)也是造成細菌對多黏菌素產(chǎn)生耐藥性的重要機制之一，可使多黏菌素對其MIC達到1.5～48μg/mL[18]。在多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌耐藥菌中還有較多的庚?；闹|(zhì)A。這些以脂質(zhì)A修飾造成的耐藥機制，與其他一些腸桿菌科細菌對多黏菌素產(chǎn)生耐藥的機制相同。

圖1 多黏菌素B和多黏菌素E的結構Fig. 1 The structure of polymyxin B and colistin

脂多糖完全缺失的鮑曼不動桿菌，首先由Moffatt等[11]在含有高濃度黏菌素(10μg/mL)的固體培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)測定其細胞膜表面的脂多糖缺失，且脂質(zhì)A的合成基因lpxACD發(fā)生核苷酸突變或缺失。通過質(zhì)粒pAL840導入完整的lpxA基因，可使其對黏菌素敏感性恢復。此耐藥機制在鮑曼不動桿菌ATCC19606以及臨床菌株中均有發(fā)現(xiàn)。但脂質(zhì)A僅是黏菌素作用的初級靶點，因而即使缺失脂質(zhì)A，藥物仍然具有一定的抗菌活性。

LPS對于許多革蘭陰性菌的生長至關重要，多數(shù)細菌失去LPS后無法生存[20]，而鮑曼不動桿菌在失去LPS后仍能生存并獲得對多黏菌素的耐藥性。失去LPS的鮑曼不動桿菌在適應性、表達譜、與宿主相互作用等很多方面都發(fā)生了變化。

圖2 不動桿菌脂質(zhì)A結構Fig. 2 The structure of lipid A of Acinetobacter baumannii

為進一步研究LPS缺失引起的基因表達的改變，Henry等[16]使用高通量RNA測序比較耐藥株19606R和敏感株ATCC19606的轉(zhuǎn)錄組差異。結果顯示，耐藥菌中有229個基因表達改變，其中123個表達上調(diào)，106個表達下調(diào)。在123個上調(diào)基因中，超過9%的基因與編碼外膜蛋白與外膜合成相關蛋白有關，包括Mla逆行磷脂轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的相關基因mlaBCD表達增加5.3～7.5倍，Lol脂質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的編號基因lolA、lolB、lolD和lolE在耐藥株中表達增加4.9～27.9倍，PNAG(polyβ-1,6-N-acetylglucosamin，聚β-1,6-N-乙酰葡萄糖胺)的合成與轉(zhuǎn)運相關的pgaABCD在耐藥株中表達增加14.9～48.5倍。該結果表明耐藥株彌補LPS的缺失主要通過3個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進行調(diào)控，即Mla逆行磷脂轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，Lol脂質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，PNAG生物合成和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。此外，耐藥株的外排泵系統(tǒng)比敏感株更為活躍，可以排出細胞內(nèi)毒性物質(zhì)。這一系列變化使缺乏LPS的外膜仍能維持其功能，以保證細菌存活與生長。

一個有趣的現(xiàn)象是，這種LPS缺失的革蘭陰性菌對阿奇霉素、利福平、萬古霉素等抗生素敏感性提高，分析推測的原因可能是：原存在于外膜上的LPS分子之間有很強的橫向相互作用，因而對于胞外物質(zhì)具有較強的選擇性透過作用。而當LPS缺失后，這種橫向相互作用下降，致使選擇透過作用下降。這一改變提示這些抗生素或許可以成為針對LPS缺失耐藥株的潛在的治療選擇[11,21]。

2 LPS缺失鮑曼不動桿菌的表面結構變化

耐藥鮑曼不動桿菌在高濃度多黏菌素(32mg/L)以及無多黏菌素時都能保持完整，有明顯的細胞聚集，也會聚集成鏈或集落。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)即使缺失了LPS，耐藥株仍有外膜存在[11]。另外，LPS缺失鮑曼不動桿菌的形態(tài)也會發(fā)生變化：在對數(shù)生長期，敏感菌呈棒狀，耐藥菌株偏圓形；平臺穩(wěn)定期敏感菌在無抗生素條件下發(fā)生細胞延長，呈細長狀，耐藥菌株也略微延長，呈短棒狀[22-23]。

在進行研究中檢測細菌表面電荷量十分必要，因為鮑曼不動桿菌對多肽類抗生素如多黏菌素的敏感性與細菌表面電荷有著密切的關系[14]。細菌表面電荷量可用Zeta電位表示。

Soon等[14]分別在多黏菌素B或黏菌素(1、4和8mg/L)存在下對細菌電位進行測定。結果顯示，在8mg/L多黏菌素B或黏菌素存在下鮑曼不動桿菌敏感菌株與耐藥菌株的Zeta電位均顯著上升，且數(shù)值高于1與4mg/L條件下的上升值。表明多黏菌素的存在對細菌表面負電荷有中和作用，且藥物濃度越高，中和作用越強，Zeta電位也就越高。在耐藥菌株中，外膜負電荷均比敏感菌株有所減少，對多黏菌素的中和作用減弱。盡管中和耐藥菌和敏感菌負電荷所需多黏菌素差別不大，但耐藥株比敏感株的耐藥性高100倍以上。

同時Soon等[23]運用原子力顯微技術研究敏感菌株與LPS缺失耐藥菌株表面性能的差異，多黏菌素暴露量與生長階段對表面性能產(chǎn)生不同的影響。結果表明，在每個生長階段，敏感菌株比耐藥菌株表面更加堅硬，機械強度更大，可能是敏感菌中的二價陽離子的橋連作用以及脂質(zhì)A鏈飽和烴之間的橫向作用形成了堅硬的外膜[24]。熒光探針實驗證明基因回補株可以產(chǎn)LPS，但表面機械強度小于敏感菌株，可能暗示回補菌株的LPS含量少于敏感菌株。對于敏感菌株，用低濃度多黏菌素(1mg/L)處理使其機械強度降低，因多黏菌素與細菌特異性結合使外膜變得不穩(wěn)定；而高濃度多黏菌素(32mg/L)處理使其機械強度增加，因多黏菌素與LPS特異性結合位點已飽和，非特異性結合被放大，多黏菌素在外膜上積聚引起機械強度增加。對于耐藥菌株，多黏菌素均以非特異性方式與LPS結合，因此高低濃度均能增加其機械強度[23]。

另外，在生長速率方面，多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌與敏感菌在MH瓊脂(MHA)平板上的生長速率相近，但耐藥株的菌落形態(tài)變小[11]。Mu等[25]的研究結果顯示，LPS缺失耐藥株的生長速度減慢。

3 LPS缺失的鮑曼不動桿菌對宿主的影響

3.1 對細胞毒力的影響

LPS中的脂質(zhì)A是革蘭陰性菌致病物質(zhì)內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎，因此LPS的存在與否影響細胞毒力[26]。

分別用敏感菌株和LPS缺失耐藥突變菌株感染小鼠模型，根據(jù)小鼠存活率及半數(shù)致死量LD50等指標判斷細菌毒力。在ATCC19606的菌落數(shù)為1×107、4×107、12×107以及40×107CFU/mL時，小鼠死亡率分別為0、0、80%和100%。在耐藥菌株菌落數(shù)為3×107，12×107，25×107，40×107以及80×107CFU/mL時，小鼠死亡率分別為0、0、0、20%和60%。半數(shù)致死量分別為10×107和63.5×107CFU/mL。由此可見，LPS缺失使細菌毒力大大降低[27-28]。

3.2 對固有免疫系統(tǒng)的影響

當細菌入侵宿主，宿主會首先啟動固有免疫系統(tǒng)抵御細菌的入侵。單核巨噬細胞表面的CD14分子和Toll樣受體識別細菌，與細菌表面的LPS結合，激活NF-κB信號通路，能夠改變基因的表達，通路激活后可引起機體發(fā)生炎癥反應[29]，比如巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)，主要是TNF-α，發(fā)揮抗感染的作用。

MyD88是Toll樣受體信號通路中重要的轉(zhuǎn)導蛋白，TLR2與TLR4通過轉(zhuǎn)導蛋白MyD88與Mal作用傳遞信號。研究者分別選取了TLR2缺失、TLR4缺失及MyD88/Mal缺失小鼠的巨噬細胞，用加熱滅活的LPS缺失耐藥菌株19606R與標準菌株ATCC19606對其進行刺激，檢測TNF-α產(chǎn)生的量，研究固有免疫在敏感和耐藥菌株中如何產(chǎn)生TNF-α。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏MyD88/Mal時未見明顯的TNF-α產(chǎn)生，證明與MyD88/Mal的信號轉(zhuǎn)導有關。在TLR-4缺失的巨噬細胞中，LPS缺失耐藥株能刺激更多的TNF-α分泌，在TLR2缺失細胞，結果相反。表明LPS缺失鮑曼不動桿菌在一定程度上通過TLR-2信號通路刺激TNF-α的分泌，但分泌水平低于敏感菌，故不會導致由TNF-α過度分泌導致的感染性休克[30]。

比較LPS缺失耐藥菌株與敏感菌株引起的固有免疫的差異發(fā)現(xiàn)，LPS缺失使得NF-κB信號通路的激活減弱，TNF-α的分泌也有所減少，因此宿主對細菌的固有免疫應答減少。

LL-37是存在于人血清中的陽離子抗菌肽，由中性粒細胞和上皮細胞產(chǎn)生，可直接殺滅大量病原菌菌落，在固有免疫的調(diào)控中起重要作用。LL-37與黏菌素的抗菌作用機制有相似之處，最初都是因為靜電吸引[31]。與多黏菌素不同的是，LL-37對LPS缺失耐藥株有殺菌作用，且耐藥株比敏感株對LL-37的敏感度更高，說明其殺菌作用不依賴于LPS，可能與膜滲透性下降有關[32]。有研究證實LL-37對許多革蘭陰性菌、病毒和真菌也有殺菌作用，也證明其不依賴于LPS發(fā)揮作用[31]。

另外，存在于黏膜分泌物中的溶菌酶也對細菌有殺滅作用，其作用靶部位是肽聚糖，LPS缺失后，細菌內(nèi)壁層的肽聚糖暴露，溶菌酶更易接近靶部位，水解肽聚糖，故LPS缺失耐藥菌株對溶菌酶的敏感性更高，使其更易被清除[33]。

4 小結

多黏菌素耐藥性的日趨嚴重將使得臨床上治療鮑曼不動桿菌感染面臨無藥可用的困境。LPS缺失所致耐藥可引起細菌適應性下降，外膜合成相關基因表達增加，對其他抗生素敏感性提高，機械強度降低，細菌毒力下降，固有免疫因子水平變化等。

以脂多糖缺失所致多黏菌素耐藥的鮑曼不動桿菌一系列性質(zhì)的改變?yōu)槌霭l(fā)點，進一步深入研究鮑曼不動桿菌對多黏菌素耐藥機制，尋找新的有效的抗菌作用靶點或者抗菌物質(zhì)，或許會獲得意想不到的結果。