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    廣東省肇慶市肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性與MLST分型研究

    2019-03-13 07:07:52蘇樂斌李柏生譚海芳朱穎梅林鳳黎碧堅(jiān)
    中國抗生素雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:菌素克雷伯檢出率

    蘇樂斌 李柏生 譚海芳 朱穎梅 林鳳 黎碧堅(jiān)

    (1 肇慶市疾病預(yù)防控制中心,肇慶 526060;2 廣東省疾病預(yù)防控制中心,廣州 511400)

    肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae, KP)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬,革蘭陰性菌,是臨床上最常見的條件致病菌之一,可引起肺炎、尿路感染、血流感染等一系列感染性疾病。近20年來發(fā)現(xiàn),肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重,產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(ESBLsKP)及耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的陸續(xù)出現(xiàn),使得肺炎克雷伯菌成為院內(nèi)感染的主要致病菌[1]。同時(shí),由高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)引起的社區(qū)性獲得性肺炎克雷伯菌感染也層出不窮[2-3],。近年來,甚至發(fā)現(xiàn)一些產(chǎn)ESBLs的hvKP和其他類型的多重耐藥hvKP患者[4-5]。高毒力同時(shí)攜帶多重耐藥性的肺炎克雷伯菌將給公共衛(wèi)生的防控和臨床患者的治療帶來極大的挑戰(zhàn)。本次研究通過對(duì)廣東省肇慶市2家醫(yī)院收集的63株肺炎克雷伯菌臨床分離株開展體外抗生素敏感性試驗(yàn)與MLST,及時(shí)掌握本地區(qū)肺炎克雷伯菌的耐藥譜和菌群群落分布特征,有助于本地區(qū)醫(yī)院加強(qiáng)和改進(jìn)院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)和控制措施,合理使用抗生素,同時(shí)也為公共衛(wèi)生的防控提供技術(shù)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 菌株來源

    收集2017年11月—2018年4月廣東省肇慶市2家醫(yī)院所有從住院患者分離到的肺炎克雷伯菌,共63株,所分離菌株均來源于痰、血、中段尿等患者標(biāo)本。經(jīng)VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定,其中分析儀器由法國Bio-Mérieux公司生產(chǎn)。質(zhì)控菌株分別為:大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603。

    1.2 主要儀器與試劑

    VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析(法國Bio-Mérieux公司),PCR儀(德國Senso Quest Labcycler公司),革蘭陰性菌藥敏檢測(cè)板(上海星百醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),貨號(hào)為A-3009XS、A-4009XS),PrimeSTAR?Max DNA Polymerase試劑(大連寶生物科技公司,貨號(hào)為R045A),血瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,貨號(hào)為024070),質(zhì)控菌株分別為:大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603。

    1.3 MLST管家基因引物

    7個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB)引物序列參照MLST數(shù)據(jù)庫(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)。引物序列由上海生物工程有限公司合成。

    2 方法

    2.1 黏液拉絲試驗(yàn)

    用接種環(huán)輕觸血瓊脂平板上過夜培養(yǎng)的新鮮菌落向外牽拉,重復(fù)牽拉兩次。若兩次均有黏液絲形成并且長度大于5mm,為黏液拉絲試驗(yàn)陽性菌株,即為hvKP。

    2.2 藥物敏感性試驗(yàn)

    藥敏試驗(yàn)使用商品化革蘭陰性菌藥敏檢測(cè)板,嚴(yán)格按廠家說明書進(jìn)行操作,并使用上海星百醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司的配套軟件判讀最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。

    2.3 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

    采用水煮法粗提DNA,PCR反應(yīng)體系為12.5μL PremixTaq,引物各1μL,模板1μL,無菌水10.5μL,總體積為25μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,一個(gè)循環(huán);94℃變性30s,相應(yīng)溫度(7個(gè)位點(diǎn)的退火溫度除了gapA為60℃、tonB為45℃外,其余5個(gè)位點(diǎn)均為50℃)退火45s,72℃延伸45s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min,一個(gè)循環(huán)[10]。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,PCR產(chǎn)物陽性的,送測(cè)序公司測(cè)序后,將序列提交到MLST官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)進(jìn)行比對(duì),確定每株菌株的序列型(ST)。

    2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析與建樹

    通過在MLST官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫比較后,確定每株菌株的ST型,運(yùn)用Bio Numerics 7.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,生產(chǎn)最小生成樹(MST)和耐藥譜圖。最小生成樹(MST)圖中每個(gè)圓的大小代表相同ST型的數(shù)量,黑實(shí)線代表2個(gè)ST型間管家基因有3個(gè)或3個(gè)以下的差異,黑實(shí)線越粗,2個(gè)ST型間的管家基因差異越小。虛線代表示有2個(gè)ST型間管家基因有4個(gè)或4個(gè)以上的差異,虛線點(diǎn)越密,2個(gè)ST型間的管家基因差異越大。在種群內(nèi)部可通過比較的等位基因圖譜之間的聯(lián)系,即緊密的相關(guān)的菌株, 其等位基因圖譜是相同或相近的,可被鑒定為一個(gè)序列組(STs),無相關(guān)性的菌株的圖譜是沒有關(guān)聯(lián)的[6]。耐藥譜圖中黑色方格代表對(duì)該種抗生素耐藥,灰色方格代表對(duì)該種抗生素中度敏感,白色方格代表對(duì)該種抗生素敏感。

    3 結(jié)果

    3.1 菌株情況

    本次研究收集的63株KP全部來源于患者,年齡以50歲以上的患者占了69.84%(44/63),檢出菌株的科室以重癥監(jiān)護(hù)室(各類ICU)為主,占55.30%(35/63)。臨床標(biāo)本類型最多為痰占54.00%(34/63),其次為血占22.20%(14/63),中段尿占14.30%(9/63),傷口分泌物占4.70%(3/63),穿刺液占3.20%(2/63),腹水占1.60%(1/63)。通過黏液拉絲試驗(yàn)分類,拉絲實(shí)驗(yàn)陽性菌株(hvKP)20株,分別來源重癥監(jiān)護(hù)室(各類ICU)8株占40.00%(8/20)、泌尿外科2株占10.00%(2/20)、消化內(nèi)科2株占10.00%(2/20)、心內(nèi)科2株占10.00%(2/20)、婦科2株占10.00%(2/20)、呼吸內(nèi)科1株占5.00%(1/20)、腦病科1株占5.00%(1/20)、普外科1株占5.00%(1/20)、燒傷外科1株占5.00%(1/20)。

    3.2 菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

    63株肺KP菌株耐藥譜見圖1。由于KP對(duì)氨芐西林天然耐藥,20株hvKP對(duì)29種抗生素類藥物絕大部分是敏感的,檢出率為31.74%(20/63),其中耐藥譜為全敏感的有18株hvKP,1株hvKP(KP49)對(duì)四環(huán)素耐藥,1株hvKP(KP25)對(duì)四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑耐藥為多重耐藥菌,該株菌株分離自PICU患者;23株KP為ESBLsKP,檢出率為36.51%(23/63),且23株ESBLsKP中大部分分離自重癥監(jiān)護(hù)室(各類ICU)的患者,檢出率為47.83%(11/23),其中有4株(KP09、KP10、KP22、KP13)對(duì)多黏菌素E耐藥,對(duì)多黏菌素B中度敏感,且KP09、KP10、KP22均分離自同一醫(yī)院,而KP13則分離自另一醫(yī)院;8株KP為CRKP,耐藥譜主要表現(xiàn)為對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥,檢出率為12.70%(8/63),且8株CRKP中有7株分離重癥監(jiān)護(hù)室(各類ICU)的患者,檢出率為87.50%(7/8);剩余12株KP為多重耐藥菌MDRKP,耐藥譜表現(xiàn)為對(duì)3種或3種以上抗生素耐藥,檢出率為19.05%(12/63),重癥監(jiān)護(hù)室(各類ICU)檢出率為75.00%(9/12)。

    3.3 多位點(diǎn)序列分型(MLST)結(jié)果

    63株肺炎克雷伯菌MLST分型共發(fā)現(xiàn)41個(gè)ST型,其中ST37型有9株,ST11型5株,ST65型5株,ST23型3株,ST661型2株,ST1087型2株,ST1530型2株,ST2890型2株,其余ST型各1株。Bio Numerics軟件用于分析最小生成樹(MST)結(jié)果(圖2), STs分布比較分散,普遍存在3個(gè)或3個(gè)以上的管家基因差異,而其中較大的STs有4個(gè),分別是STs1(由ST37單獨(dú)組成)含9株產(chǎn)ESBLsKP,STs2(ST65、ST25、ST1135組成)含6株hvKP和1株MDRKP,STs3(由ST11和ST690組成)含6株CRKP,STs4(由ST23和ST218組成)含4株hvKP。菌株耐藥譜結(jié)合MLST發(fā)現(xiàn),根據(jù)耐藥譜分類的4類KP都有主要的分子流行特性(圖3):hvPK以ST23和ST65為主要流行型;ESBLsKP以ST37為主要流行型;CRKP以ST11為主要流行型;其他MDRKP的ST型呈多型別分散狀流行。

    4 討論

    肺炎克雷伯菌是臨床上常見的條件致病菌,在機(jī)體免疫力低下或長期大量使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時(shí),容易引起機(jī)會(huì)性感染。重癥監(jiān)護(hù)室、新生兒病房和老年病房是感染KP的高發(fā)區(qū)。hvKP除了引起肝膿腫,極易播散引起其他重要部位的轉(zhuǎn)移性感染且預(yù)后較差[7],而多重耐藥KP引起院內(nèi)感染暴發(fā)流行后果更嚴(yán)重,死亡率高達(dá)40%[1]。本次研究對(duì)廣東省肇慶市兩家醫(yī)院的63株KP臨床分離株進(jìn)行了抗生素敏感性試驗(yàn)和MLST分型,分離株主要來源于ICU病房,以痰和血標(biāo)本為主,感染人群集中在50以上的中老年人,這與其他地區(qū)KP醫(yī)院感染特點(diǎn)類似[1]。

    藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1),63株肺炎克雷伯菌臨床分離株中除了19株hvPK對(duì)常用抗生素仍是敏感外,其余44株分離株對(duì)大部分抗生素耐藥比較嚴(yán)重,都是表現(xiàn)為ESBLsKP或CRKP或其他類型MDRKP,這提示本地區(qū)主要醫(yī)療機(jī)構(gòu)中流行的都是具有強(qiáng)耐藥能力的肺炎克雷伯菌,需要加強(qiáng)醫(yī)院肺炎克雷伯菌院內(nèi)感染的監(jiān)測(cè)和防控。耐藥譜結(jié)合MLST分析發(fā)現(xiàn)(圖1),9株ST37型的ESBLsKP其耐藥譜存在差別,值得注意的是紅色方框內(nèi)的3株菌株(KP09、KP10和KP22)對(duì)多黏菌素E耐藥和多黏菌素B中度敏感,而紅色圓框內(nèi)的6株菌株(KP20、KP27、KP29、KP43、KP51、KP62)對(duì)多黏菌素E和多黏菌素B均敏感,KP09與KP43更是分離自同一醫(yī)院的同一個(gè)科室,多黏菌素作為目前臨床治療革蘭陰性菌感染的最后一道屏障,在多重耐藥革蘭陰性菌感染的治療中耐藥率低、治療效果好,特別是對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌效果顯著[8],而本研究這一發(fā)現(xiàn),提示我市大型綜合醫(yī)院里已開始流行耐多黏菌素E的ESBLsKP,值得防控部門高度關(guān)注。而對(duì)MLST的最小生成樹(MST)分析發(fā)現(xiàn)(圖2),不同耐藥特征的KP有不同的菌落分布特性,hvPK以ST23和ST65為主要流行型,STs分布的比較集中,這與國內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道一致[9],值得注意的ST25與ST65、ST1135分別都只有1個(gè)管家基因差異,親源關(guān)系非常密切,但耐藥譜分析顯示ST65與ST1135都是對(duì)抗生素全敏感的,ST25對(duì)7種抗生素耐藥,而KP14(ST25)與產(chǎn)ESBLs的KP52(ST17)間也只有2個(gè)管家基因差異,親源關(guān)系密切,而這8株菌株都分離自同一間醫(yī)院,KP14與KP52更是分離自同一間ICU病房,這提示該醫(yī)院可能存在優(yōu)勢(shì)的菌型,耐藥基因元件不僅在同ST型菌株間存在傳遞的風(fēng)險(xiǎn),并且在不同ST型菌株間也同樣存在該風(fēng)險(xiǎn);CRKP主要以ST11為主要流行型,ST型分布比較集中,主要在ST690周圍,彼此間的親緣關(guān)系比較近,與我國目前的主要流行型一致[10],CRKP的耐藥譜顯示除了對(duì)碳青霉烯藥物耐藥外,至少還對(duì)14種藥物耐藥;ESBLs KP主要以ST37為主要流行型,分布同樣也相對(duì)集中,主要圍繞在KP05(ST35)周圍,而耐藥譜分布也顯示不同ST型間耐藥情況差別也不大,這提示該醫(yī)院存在這個(gè)菌型的優(yōu)勢(shì)克隆群;其他類型MDRKP的ST型呈多態(tài)性分布。

    圖1 63株肺炎克雷伯菌菌株耐藥譜表Fig. 1 Drug-resistant spectrum of 63 strains of Klebsiella pneumoniae

    圖2 63株肺炎克雷伯菌最小生成樹(MST)Fig. 2 63 strains of Klebsiella pneumoniae MST

    根據(jù)本文的研究結(jié)果,可見本地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)KP臨床分離株的耐藥譜與菌落分布情況都各具特征,高毒力但抗生素敏感型的hvPK與多重耐藥的KP間呈現(xiàn)不同的菌落特征,同時(shí)不同菌落特征的菌株間存在耐藥元件相互傳遞的情況,而耐多黏菌素E的ESBLsKP出現(xiàn)尤其值得防控部門的高度關(guān)注,因此應(yīng)加強(qiáng)院內(nèi)肺炎克雷伯菌監(jiān)測(cè),防止出現(xiàn)高毒力菌株獲得多耐藥基因元件后出現(xiàn)高毒力強(qiáng)耐藥的肺炎克雷伯菌。

    圖3 4類肺炎克雷伯菌分子流行特性圖Fig. 3 Molecular epidemic characteristics of 4 types of Klebsiella pneumoniae

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