肺保護性通氣策略對單肺通氣大鼠肺組織中水通道蛋白表達的影響

周 晶, 高 巨, 米智華, 胡乃琴

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院 麻醉科, 江蘇 揚州, 225001)

在胸外科手術(shù)麻醉中，單肺通氣(OLV)是一種很重要的通氣方式，但OLV所致的肺損傷增加了術(shù)后肺部并發(fā)癥的發(fā)生率，如肺炎、肺不張、肺水腫等。肺水腫作為一種主要的肺損傷表現(xiàn)，其形成與水通道蛋白-1(AQP-1)、水通道蛋白-5(AQP-5)表達失調(diào)有關(guān)[1]。AQP-1與AQP-5對高滲透梯度下的水的通透起了重要的作用[2]。目前，國內(nèi)外研究[3]均表明，肺保護性通氣策略(LPVS)能有效降低機械通氣全麻患者術(shù)后肺部并發(fā)癥的發(fā)生率。本研究探討肺保護性通氣策略對單肺通氣大鼠肺組織中AQP-1、AQP-5表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇9～10周的成年雄性SD大鼠15只，體質(zhì)量300～400 g, 術(shù)前禁食12 h, 隨機分為對照組(C組)、肺保護通氣組(P組)、大潮氣量組(H組)，每組5只。所有大鼠予戊巴比妥麻醉誘導(dǎo)后行氣管切開，插入16G的套管針，并放置左側(cè)股靜脈留置針。將大鼠放在溫箱中，以保證體溫維持在36.5～38 ℃。C組大鼠開胸后直接放血處死，取左側(cè)肺組織行相關(guān)檢測。H組和P組大鼠在開胸后，可視下在氣管切開處將16G套管針放入左側(cè)支氣管，再放置20G套管針于主氣管，以減少漏氣。后接小動物呼吸機行左側(cè)肺單肺通氣，若左肺正常膨脹，右肺近乎塌陷，則表示插管成功[4]。

H組通氣模式為: 潮氣量10 mL/kg, 呼吸頻率50次/min。P組通氣模式為: 潮氣量6 mL/kg, 呼吸頻率50次/min, 呼氣末正壓(PEEP)5 cmH2O，并30 min進行1次肺復(fù)張(5 mL的注射器推注2 mL的氣體，持續(xù)5 s后抽出)。2組通氣氧濃度均為100%。機械通氣間的麻醉維持使用0.5%戊巴比妥，以4 mL/(kg·h)速度于左側(cè)股靜脈處靜滴。2組大鼠均持續(xù)單肺通氣4 h, 后放血處死，取左肺組織行相關(guān)檢測。

1.2 評價標(biāo)準(zhǔn)

采用免疫組化法測定肺組織AQP-1和AQP-5蛋白的表達(定性)。免疫組化染色按試劑盒說明書操作。采用RT-PCR法測定AQP-1 mRNA和AQP-5 mRNA的表達。取肺組織，應(yīng)用Trizol試劑提取肺組織總RNA。取總RNA 2 μg行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴增AQP-1和AQP-5, 以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，每個樣本重復(fù)3次。AQP-1的上游引物為5′-TCTGGAGGGCTGTGGTGGCT-3′, 下游引物為5′-AAGTGAGTTCTCGAGCAGGGA-3′; AQP-5的上游引物為5′-TGGGTCTTCTGGGTAGGGCCTATTGT-3′, 下游引物為5′-GCCGGCTTTTGGCACTTGAGATACT-3′。PCR反應(yīng)條件為: 以94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s為1個循環(huán)，共計40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt的方法比較不同樣本的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料以[n(%)]表示。組間計量資料比較采用單因素方差分析檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

免疫組化法檢測AQP-1和AQP-5蛋白的表達(定性)結(jié)果顯示, 3組AQP-1蛋白無明顯差異, C組和P組中均有AQP-5蛋白的表達, H組未見明顯AQP-5蛋白表達。見圖1、2。P組、H組大鼠肺組織中AQP-1 mRNA表達水平分別為(1.007±0.140)、(0.738±0.155), 均低于C組的(1.025±0.095), 其中P組與C組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), H組與C組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時, P組大鼠肺組織中AQP-1 mRNA表達水平也顯著高于H組(P<0.05)。

P組、H組大鼠肺組織中AQP-5 mRNA表達水平分別為(0.937±0.163)、(0.680±0.107), 均低于C組的(1.028±0.141), 其中P組與C組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), H組與C組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時, P組大鼠肺組織中AQP-5 mRNA表達水平也高于H組, 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

P組、H組大鼠肺組織濕/干比值分別為(5.364±0.100)、(5.784±0.217), 均大于C組的(4.896±0.240), 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 且H組大鼠肺組織濕/干比值也顯著大于C組(P<0.01)。

圖1 3組AQP-1蛋白的表達(200倍)

圖2 3組AQP-5蛋白的表達(200倍)

3 討 論

單肺通氣是非生理性的通氣方式，易誘發(fā)術(shù)后肺損傷，甚至導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。調(diào)查[5]顯示，肺切除術(shù)后急性肺損傷的發(fā)生率高達12%，其原因與單肺通氣時潮氣量過大和氣道壓偏高有關(guān)。大潮氣量機械通氣還會在肺泡表面產(chǎn)生過度的機械刺激(如牽拉剪切力等)，而過度機械刺激可激活p38MAPK信號通路[6-7]。p38MAPK通路激活后可通過多種途徑誘發(fā)或加重機械通氣相關(guān)性肺損傷。研究[8-9]表明, p38MAPK通路激活可下調(diào)AQP-5的表達。

水通道蛋白(AQPs)是水分子跨膜運輸?shù)墓δ苄酝ǖ赖鞍?。肺組織中有6種AQP表達，在外周肺表達的AQP主要是水通道蛋白AQP-1、AQP-5。AQP-1主要分布于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮[10], 清除支氣管和脈管周圍組織的水分; AQP-5主要分布在肺泡Ⅰ型細(xì)胞的頂膜面，清除肺泡內(nèi)水分[11]。AQPs是一種對水具有特異性轉(zhuǎn)運功能的細(xì)胞膜通道蛋白，具有抵抗肺水腫形成的作用[12-13]。研究[14-15]表明，生理和病理狀態(tài)下AQPs在肺泡細(xì)胞的水平衡調(diào)節(jié)中都有重要的作用。試驗[16]證實AQP-1、AQP-5表達下調(diào)參與了機械通氣誘發(fā)大鼠肺水腫的發(fā)生。

本研究中，給予單肺通氣大鼠4 h的不同模式的機械通氣，兩種通氣模式均增加肺組織濕/干比值，考慮長時間機械通氣導(dǎo)致的肺損傷，肺水增多是其重要原因之一。肺保護性通氣模式下的濕/干比值相對較小，提示肺保護通氣策略對肺組織有一定的保護作用。本研究結(jié)果顯示，兩種通氣模式均導(dǎo)致肺組織中AQP-1 mRNA和AQP-5 mRNA表達降低，影響肺水轉(zhuǎn)運，這是導(dǎo)致肺水增多的重要原因之一。肺保護性通氣策略對AQP-1 mRNA和AQP-5 mRNA表達的影響相對較小。本結(jié)果與不同通氣模式對肺組織濕/干比值影響趨勢一致，考慮機械通氣所致的肺水增多(甚至肺水腫)與AQP-1和AQP-5蛋白的表達下調(diào)有關(guān)。因此，在行單肺通氣的過程中，有效實施肺保護性通氣策略能夠降低AQP-1和AQP-5下調(diào)的幅度。