艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜對冷卻豬肉的保鮮效果

徐鑫，陶宏志，吳平華，徐幸蓮，韓敏義

(1.六安職業(yè)技術(shù)學(xué)院a.經(jīng)濟管理學(xué)院；b.城市建設(shè)學(xué)院，安徽六安 237158；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210095；3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051)

0 引言

冷卻肉因具有營養(yǎng)豐富、肉嫩味美、衛(wèi)生安全等優(yōu)點深受消費者喜愛，是我國肉類消費的主流趨勢，但在0～4℃流通、冷藏、銷售和加工過程，很難抑制肉內(nèi)源酶活性和嗜冷微生物繁殖及氧化作用的影響，容易造成肉腐敗變質(zhì).因此，對冷卻肉采取適當(dāng)處理，控制其品質(zhì)，延長貨架期是冷卻肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵.目前，國內(nèi)外常用的冷卻肉保鮮方法有低溫、冰溫、微凍、高壓技術(shù)、氣調(diào)包裝、輻射、化學(xué)保鮮和生物保鮮等.隨著人們生活水平的提高及人類健康意識的增強，采用廣譜、低毒和高效的天然防腐方法來延長豬肉保質(zhì)期的研究和應(yīng)用已成為熱門課題.

艾蒿(Artemisia argyi H.evl.et Vent)為菊科蒿屬多年生草本植物，分布全國各地，在皖南和大別山區(qū)廣泛種植，為我國中醫(yī)臨床常用藥，富含揮發(fā)油、黃酮類，同時還含三萜類、多糖、鞣質(zhì)及微量元素等多種功能性成分，具有殺蟲、抑菌、抗氧化、防衰老和抗癌等多種功能[1].周許峰[2]、馮曉慧[3]等研究發(fā)現(xiàn)，天然生物提取物分別對SMMC-7721肝癌細(xì)胞株、肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖起抑制和促凋亡功能；孫義玄和包怡紅研究發(fā)現(xiàn)艾蒿多糖對革蘭氏陽性細(xì)菌具有很強的抑制作用[4].又艾蒿無毒又可提高食品固有品質(zhì)的特性，民間將艾葉為原料制作艾酒、艾醬、艾餅和艾葉饅頭等食品[5]，但在食品保鮮則鮮見報道；另外，植物精油在不同乳化條件下，可以均勻穩(wěn)定的分散在以殼聚糖、羧甲基纖維素鈉為載體溶液中，是一種理想的涂膜保鮮材料[6].因此，本試驗采用天然可食用的艾蒿精油(Artemisia argyi H.evl.et Vent Linn oil，AO)和VE為原料，以殼聚糖(CH)為載體，制得冷卻肉艾蒿精油-殼聚糖-VE(AO-CH-VE)復(fù)合涂膜液，探討其對冷卻豬肉品質(zhì)的影響.冷藏第10天根據(jù)GB/T22210-2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》進(jìn)行感官評分，用模糊綜合評判法對豬肉感官得分進(jìn)行計算，確定保鮮涂膜材料的最佳配方；然后用最佳復(fù)合涂膜處理冷卻豬肉與對照組(無菌蒸餾水浸泡處理)比較，每2天分別對冷卻肉的復(fù)合涂膜組和對照組的pH值、總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base-nitrogen, TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid resctive subastances, TBARS)、汁液流失率(drip loss,DL)和菌落總數(shù)(Colony Forming Units，CFU)為評價指標(biāo)，考察艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜材料對冷卻豬肉的保鮮作用，旨在尋求綠色、高效和實用的天然生物保鮮涂膜劑，為肉及其制品的保鮮和品質(zhì)提升開辟全新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉：從安徽省西商屠宰廠常規(guī)屠宰后3 h內(nèi)，無菌操作取霍壽黑毛豬后腿肉，修去筋腱，無菌薄膜包裝迅速轉(zhuǎn)運到實驗室待用；艾蒿：2018年6月采自安徽涇縣茂林鎮(zhèn)銅山村生態(tài)林內(nèi)野生種類，經(jīng)課題組研究團隊鑒別為菊科植物艾蒿，去掉死葉，通風(fēng)陰涼處自然風(fēng)干后，取莖葉，用高速組織粉碎機粉碎，過80目篩密封2℃保存?zhèn)溆茫?410黑色聚丙烯托盤(PP)：食品材質(zhì)PP料(QS質(zhì)量認(rèn)證),14cm*10cm*2cm，臺州市路橋晨亨塑料廠；食品級保鮮膜(PE)：30cm*20m，廣州市亞廚日用品有限公司；α-殼聚糖：CH，脫乙酰度≥90%，分子質(zhì)量282kD，南通興成生物制品廠 ； VE：食品級，純度≥98%，鄭州福潤德生物工程有限公司；乙酸：食品級，含量≥99.8%，天然度≥95%，鄒平縣臺子福利醋酸加工廠；雙氧水：南京建成生物工程研究所；食用酒精、檸檬酸、甘油：廣州化學(xué)試劑廠；其它試劑為分析純或化學(xué)純.

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺：SB-IS-1A型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2450型紫外可見分光光度計：日本島津公司；電子天平：JA2003型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；Agilent1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；TD3C800B離心機、索式提取器：湖南研科生物有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-5299,上海亞榮生化儀器廠；NJL07-3型實驗專用微波爐：南京杰全微波設(shè)備有限公司；電熱干燥箱：GZX-RH202型，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠； pH儀: 雷磁PHBJ-260型，上海精密儀器儀表有限公司;半微量凱氏定氮儀：廣州儀器廠；DFY-250A高速組織粉碎機：上海比朗儀器有限公司；80～90目篩、天平、鐵架臺、漏斗、濾紙、圓底燒瓶、錐形瓶、玻璃缸、燒杯、玻璃棒等.

1.3 方法

1.3.1 肉樣處理

將運回實驗室霍壽黑毛豬后腿肉經(jīng)檢疫合格后，無菌操作踢去筋膜及多余的脂肪，浸入30%食品級H2O2中20s滅菌，取出用3倍肉樣重量的無菌水清洗其表面后，用徐鑫，韓敏義[7]等二段式冷卻法充分排酸24h后，用消毒過刀具和案板等工具切成小塊((100±10)g)，共30塊，隨機分成10組，每組3塊.

1.3.2 艾蒿精油的提取

稱取艾蒿粉600 g置于圓底燒瓶中→加入無水乙醇1000 ml→80℃溫水浴中索式提取→艾蒿提取物在圓底燒瓶中富集(8次重復(fù))→蒸餾除去揮發(fā)油中的乙醇→得到艾蒿精油2.9mL(約0.5%提取率)→密封置于冰箱冷藏室控制(4±0.5)℃中保藏備用[7].

1.3.3 艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜液的制備

量取10 mL冰醋酸溶于蒸餾水中，配制體積分?jǐn)?shù)1%醋酸溶液.以1%的醋酸溶液為稀釋液，分別按表1所示添加一定量的艾蒿精油、殼聚糖和VE后，分別于50℃、300W功率下超聲處理10min后，用磁力攪拌棒攪拌使溶劑完全溶解并均勻混合后，采用0.15MPa、121℃、15min的高壓蒸汽滅菌，冷卻至室溫密封放入冰箱控制(4±0.5)℃冷藏備用.

1.3.4 艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜處理試驗設(shè)計

根據(jù)前期試驗結(jié)果，采用艾蒿精油、殼聚糖和VE為試驗因素，取值水平分別為0.25～1.00%、0.30～0.5%、0.05～0.15%，選取L9(33)正交試驗，優(yōu)化復(fù)合保鮮劑配比.

將肉樣分別置于復(fù)合保鮮劑浸泡液中浸漬3min，取出自然瀝干保鮮液3～5min左右，同時以無菌蒸餾水浸泡處理的肉樣作為對照組，以艾蒿精油、殼聚糖和VE最佳配比的復(fù)合保鮮劑浸泡處理的肉塊作為驗證組.以上各組肉塊均裝入消毒過的聚丙烯托盤，用保鮮膜封口置于(4±0.5)℃冰箱冷藏，每2天取樣測定每組菌落總數(shù)(Colony Forming Units，CFU)、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base-nitrogen, TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid resctive subastances, TBARS)和汁液流失率(drip loss,DL)等指標(biāo),每個試驗3次重復(fù)取均值，第10天進(jìn)行感官評定，以評價艾蒿精油復(fù)合劑對冷卻肉品質(zhì)變化的影響.

表1 正交試驗因素水平表

1.4 艾蒿精油-殼聚糖-VE(AO-CH-VE)復(fù)合涂膜保鮮劑對冷卻豬肉保鮮效果的測定

1.4.1 冷卻肉感官評定標(biāo)準(zhǔn)

本研究按GB/T22210-2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》進(jìn)行感官評分，挑選有一定的專業(yè)基礎(chǔ)、感官評價經(jīng)驗和無生理缺陷教師與學(xué)生共10名，從豬肉色澤、氣味、組織狀態(tài)和滋味4個方面分別評分.每項指標(biāo)分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V(即新鮮、較新鮮、一般、較差、差)等5個等級進(jìn)行評價，評分標(biāo)準(zhǔn): 10～9分，Ⅰ(肌肉有光澤、顏色鮮紅、氣味正常、柔軟彈性好、無汁液流失、肉湯鮮香) ; 9～8分，Ⅱ(肌肉顏色稍暗、有光澤，鮮味淡、無異味，少量汁液流失，彈性較強，肉湯較香);8～7 分，Ⅲ(顏色暗紅，汁液流失較多，肉湯不香，彈性弱);7～6 分，Ⅳ( 肉表面 1/3 變褐色，略有異味，無彈性，汁液流失多，肉湯渾，有異味);6～5分，V(肉表面大部分變褐色，有明顯異味，無彈性，汁液大量流失，肉湯變色，異味重).

1.4.2 冷卻肉感官質(zhì)量的模糊綜合評價

1.5 冷卻豬肉理化指標(biāo)測定

1.5.1 菌落總數(shù)(Colony Forming Units，CFU)的測定

參照GB/T4789.2-2016規(guī)定稀釋平板傾注計數(shù)法每 2d 測定一次，結(jié)果以lg( CFU，Colony Forming Unit) 計，肉樣檢測指標(biāo)超標(biāo)后實驗終止.

1.5.2 pH值的測定

使用上海雷磁PHBJ-260便攜式PH計按GB /T 5009.237- 2016規(guī)定方法測定.

1.5.3 揮發(fā)性鹽基氮( Total Volatile Basic Nitro-gen，TVB- N)的測定

參照 GB/T 5009.228-2016 規(guī)定，采用半微量凱式定氮法進(jìn)行，結(jié)果大于20mg/100g判定為品質(zhì)超標(biāo).

1.5.4 硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric Acid Reactive Substances, TBARS) 的測定

參考呂永平和徐鑫[7]的方法測定TBARS 值.

1.5.5 肉樣汁流失率(drip loss，DL)的測定

涂膜晾干后的肉樣重量為(w0)，每 2d 從保鮮模封口的聚丙烯托盤中取出肉樣，用殺菌過的濾紙輕輕擦干肉樣表層汁液后稱重(wt) .其汁流失率(DL):

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗設(shè)3個平行，取平均值.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用SPSS 22.0軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示，顯著和極顯著差異P分別小于0.05和0.01；采用Excel2007作試驗數(shù)據(jù)圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果分析

以艾蒿精油、殼聚糖、VE添加量為因素，第10d按1.4.1的感官評定標(biāo)準(zhǔn)對冷卻豬肉的感官質(zhì)量評分，按1.4.2方法對冷卻豬肉的感官質(zhì)量評分計算出模糊綜合評價結(jié)果，見表3.

由表3可知，影響冷卻豬肉感官質(zhì)量因子的主次順序為艾蒿精油(A)、殼聚糖 (B)、VE(C),艾蒿精油(A)>殼聚糖(B)> VE(C)，優(yōu)化組合為，即艾蒿精油0.50%，殼聚糖0.40%，VE0.10%.

針對優(yōu)化條件進(jìn)行驗證實驗，10d時冷卻豬肉的感官模糊綜合評判得分為8.75分，屬于Ⅱ級，其結(jié)果優(yōu)于其它組別配伍試驗.

表2 L9(33) 正交試驗結(jié)果

2.2 艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜保鮮劑對冷卻豬肉保鮮效果

2.2.1 菌落總數(shù)(Colony Forming Units，CFU)的變化

菌落總數(shù)是判斷食品被微生物污染程度和衛(wèi)生質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)，故菌落總數(shù)直觀地反映冷卻肉品質(zhì)變化情況.由圖1可知，兩組菌落總數(shù)隨冷藏時間的延長均有不同程度的增加.在0～2 d，對照組菌落總數(shù)增長緩慢與艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組的菌落總數(shù)值差異不顯著(p>0.05)；2天后對照組菌落總數(shù)增長速度顯著快于艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組(p<0.05)，第4天就達(dá)到3.59(lg(CFU/g)，菌落總數(shù)已接近國家標(biāo)準(zhǔn)限定值4.00(lgCFU/g)；艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組微生物的生長繁殖緩慢，第12天菌落總數(shù)達(dá)到3.72(lg(CFU/g))，接近國家標(biāo)準(zhǔn)限定值.說明艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組能有效地抑制微生物的生長繁殖.孫義玄和包怡紅等[4]分別運用不同方法得到艾蒿精油在低溫下對生長繁殖革蘭氏陽性的葡萄球菌屬(Staphylococcus)，兼性厭氧的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物有很強的抑制作用，由此推測艾蒿精油-殼聚糖-VE涂膜能延緩冷卻豬肉冷藏期間菌落總數(shù)的上升，可能與其對大腸桿菌的抑制有關(guān).

圖1 冷卻肉冷藏過程中菌落總數(shù)的變化

2.2.2 pH值的變化

pH值是評價豬肉新鮮變化的重要指標(biāo).豬肉屠宰后經(jīng)僵硬到自溶的冷卻階段pH值由中性降到圖2的5.81，隨冷藏時間的不斷延長，冷卻豬肉的肌動球蛋白離解為肌球蛋白與肌動蛋白，可能又受革蘭氏陰性菌污染和酶的作用下，蛋白質(zhì)被分解為氨和胺類化合物等堿性物質(zhì)，兩組樣品的pH值都在增加.對照組的pH值快速上升，第6天達(dá)6.48接近6.76的變質(zhì)肉標(biāo)準(zhǔn)；而艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組pH值前期下降然后緩慢上升，到第12天達(dá)6.32還未達(dá)到變質(zhì)肉pH>6.76標(biāo)準(zhǔn)，與對照組比較，pH變化差異顯著(p<0.05).說明艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組能有效阻止豬肉冷藏過程中的的自溶腐敗，達(dá)到較好的保鮮效果.

圖2 冷卻肉冷藏過程中pH值的變化

2.2.3 TVB-N的變化

總揮發(fā)性鹽基氮( TVB-N)是判斷肉類新鮮程度的客觀指標(biāo)，并與感官變化一致.從圖3可知，隨著冷藏時間的不斷延長，冷卻肉對照組和艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組的樣品在微生物和酶的作用下，TVB-N值變化趨勢大致一致.但在冷藏2d前，對照組和精油-殼聚糖-VE復(fù)膜組間TVB-N值無顯著差異(P>0.05)；第 3d 時，對照組上升較快，第6天達(dá)19.97mg/100 g，已接近變質(zhì)肉20 mg/100 g的標(biāo)準(zhǔn)，而艾蒿精油-殼聚糖-復(fù)合涂膜組在第12天TVB-N值14.89mg/100 g≤20 mg/100 g，仍在二級鮮肉的范圍內(nèi)，上升速度明顯慢于對照樣(p<0.05).由此推測，復(fù)合膜具有良好的阻止外界環(huán)境氧氣和水分的影響，能顯著抑制冷卻肉中內(nèi)源酶活性和腐敗菌的生長繁殖，從而延緩蛋白質(zhì)分解氨(NH3)及胺類(RCH2NH2)等堿性含氮揮發(fā)性物質(zhì).以上驗證，艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組延長冷卻肉的貨架期.

圖3 冷卻肉冷藏過程中TVB-N含量的變化

2.2.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物值(TBARS)的變化

TBARS值是表征含脂肪類物質(zhì)脂肪二級氧化產(chǎn)物的多少，是評價脂肪氧化酸敗程度的重要指標(biāo).從圖4可知，對照組和艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組隨著冷藏時間延長，冷卻豬肉TBARS值均呈上升趨勢，變質(zhì)和產(chǎn)生異味的冷藏天數(shù)，CK組在第6 d為0.71mg/kg>0.50mg/kg；艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組第10 d為0.69mg/kg>0.50mg/kg，兩者之間差異顯著(p<0.05), 驗證艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組能有效抑制冷卻肉冷藏期間的脂質(zhì)物質(zhì)氧化酸敗，控制肉樣內(nèi)源酶活性和腐敗菌繁殖，延長其貨架期.研究結(jié)果與劉占東和李璐等[8]研究的肉桂精油在一定程度上抑制冷卻肉脂肪氧化相一致，原因可能植物精油富含多種抗氧化活性成分，對細(xì)菌具有抑制作用，對DPPH自由基和羥自由基具有很強的清除能力有關(guān)[9].

圖4 冷卻肉冷藏過程中TBARS值的變化

2.2.5 汁液流失率(DL)的變化

肌肉汁液流失率程度直接影響肉的營養(yǎng)成分、色香味、嫩度等食用品質(zhì).由圖5可知，對照組和艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組隨著冷藏時間延長，冷卻豬肉汁液流失率皆呈上升趨勢.可能原因是冷卻豬肉在冷藏期間細(xì)菌生長繁殖造成肉組織結(jié)構(gòu)收縮與肌肉蛋白質(zhì)膠體發(fā)生了不可逆變化，致使肌肉持水性降低，凝膠組織中水分流出.對照組冷藏6天冷卻肉汁液流失率為9.64%，而艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組冷藏12天汁液流失率僅為6.32%，兩者之間差異顯著(p<0.05).說明艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組抑制豬肉組織膜脂氧化作用[10]，顯著降低冷卻豬肉的細(xì)胞膜的通透性，提高肉樣保水性.可能原因是殼聚糖在肉樣形成薄膜阻止肉樣與外界環(huán)境中氧氣和腐敗微生物的接觸，又殼聚糖、艾蒿精油和VE協(xié)同抑制肉樣腐敗微生物活動和繁殖，雙方耦合抑制了肉樣蛋白結(jié)構(gòu)的變形與破壞，從而降低肉樣汁液流失[11].

圖5 冷卻肉冷藏過程中汁液流失率的變化

3 結(jié)論與討論

3.1 艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組對冷卻豬肉具有顯著的保鮮效果，通過模糊數(shù)學(xué)綜合感官評價，得出最佳復(fù)合涂膜液配比為艾蒿精油0.50%(v/v)、殼聚糖0.40%(m/v)、VE0.10%(m/v).能有效延長冷卻豬肉貨架期.

3.2 冷卻豬肉的艾蒿精油-殼聚糖-VE復(fù)合涂膜組與對照組相比，3d后冷卻豬肉冷藏豬肉的復(fù)合涂膜組CFU、pH值、TVB-N、TBARS、DL與對照組之間差異顯著(P<0.05)，其第10d冷卻豬肉的復(fù)配組的感官模糊綜合評判得分為8.75分，屬于Ⅱ級.

3.3 本試驗研制了在天然涂膜材料殼聚糖溶液添加天然抗氧和抑菌劑艾蒿精油和VE對冷卻肉涂膜，降低冷卻肉中內(nèi)源酶活性，減緩微生物活動，提高了冷卻肉冷藏的保鮮效果，延長其貨架期.由此推測，天然生物保鮮劑在冷卻肉涂膜保鮮中具有良好的應(yīng)用前景.

艾蒿為藥食兩用植物，全國各地盛產(chǎn)豐富，安全無毒，富含多種活性成分，抗氧化防腐效果顯著，用于冷卻肉保鮮切實可行，解決肉和肉制品在流通過程中腐敗變質(zhì)問題；艾蒿精油提取和對肉保鮮處理簡單便捷、易掌握，與丁香、肉桂和白薇等其它具有抗菌和抗氧化性能的天然植物相比，價格低廉，是規(guī)模化生產(chǎn)冷卻肉天然植物精油涂膜保鮮優(yōu)選之一.為使艾蒿精油后期更好應(yīng)用于肉類保鮮生產(chǎn)中，項目后期繼續(xù)深入研究艾蒿精油的活性成分抗菌和抗氧化機理；進(jìn)一步探討艾蒿精油復(fù)合涂膜結(jié)合氣調(diào)、輻射、納米、冷殺菌、冰凍和微凍等其他保鮮手段，對冷卻肉品質(zhì)的影響，彌補單一保鮮方法不足，更好發(fā)揮綜合保鮮優(yōu)勢.