布拉酵母菌對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠核因子-κB及腫瘤壞死因子-α表達的影響

顏玉 任秀英 鮑秀琦 姜威 羅蘭 鄭強 王雪 薛勇

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化一科，黑龍江 佳木斯 154002)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種常累及直腸和結(jié)腸的慢性炎性疾病。研究顯示其發(fā)病與宿主遺傳易感性與免疫應(yīng)答及腸黏膜免疫識別失調(diào)關(guān)系密切〔1〕，腫瘤壞死因子(TNF)-α是炎癥性腸病發(fā)病過程中關(guān)系最為密切的促炎性因子之一，動態(tài)監(jiān)測TNF-α的水平變化對UC的臨床診斷、分期、疾病活動情況及嚴(yán)重程度有重要臨床意義。核因子(NF)-κB在細胞因子的釋放與轉(zhuǎn)錄的過程中起重要調(diào)控作用。本研究觀察布拉酵母菌(億活)治療UC的效果。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 億活(布拉酵母菌散，法國百科達制藥廠)，美沙拉秦(莎爾福，Losan Pharma GmbH，德國)，兔抗鼠NF-κB(艾博抗貿(mào)易有限公司)，TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，免疫組化試劑盒(齊一生物科技有限公司)。Leica RM2265半薄全自動輪轉(zhuǎn)式切片機，SAF-680T酶標(biāo)儀(上海巴玖實業(yè)有限公司)，XSP-22CE顯微鏡(上海比目儀器有限公司)。

1.2實驗動物及分組 選用清潔級健康6～8周齡Wistar大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±50)g，由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)條件均適宜，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后按照隨機分組原則分為5組：對照組、模型組、莎爾福組、億活組、聯(lián)合治療組，每組各6只。

1.3UC大鼠動物模型及治療組模型制備 30只大鼠禁食24 h，無水乙醚麻醉。①對照組：大鼠2 ml生理鹽水灌腸。②模型組：大鼠稱重，仰臥位以2.4%水合氯醛1.2～1.4 ml/100 g腹腔注射，麻醉后，用石蠟油潤滑經(jīng)肛門輕緩插入輸液管至距肛門8 cm處，100 mg/kg三硝基苯磺酸(TNBS)加入相同體積50%乙醇注入大鼠結(jié)腸內(nèi)，隨后注入0.5 ml空氣，處理后的大鼠頭向下45°傾斜放置1 min，稍后保持平躺自然清醒，按此方法每7 d重復(fù)灌腸造模，持續(xù)至第8周〔2〕。③莎爾福組：模型大鼠用5%乙酸1.0 ml灌腸2 d后，用莎爾福溶液2.5 ml 0.5 g/(kg·d)灌胃1次。④億活組：模型大鼠用5%乙酸1.0 ml灌腸2 d后，用億活溶液2.5 ml 0.1 g/(kg·d)灌胃1次。⑤聯(lián)合治療組：模型大鼠用5%乙酸1.0 ml灌腸2 d后，用莎爾福溶液2.5 ml 5 g/(kg·d)和億活溶液2.5 ml 0.1 g/(kg·d)灌胃1次。各組大鼠經(jīng)相應(yīng)處理7 d后禁食不禁水24 h，麻醉取全血分離血清后處死大鼠剖開腹腔，分離結(jié)腸組織，生理鹽水反復(fù)輕柔沖洗干凈，肉眼觀察，選擇結(jié)腸病變最嚴(yán)重部位結(jié)腸組織，置于甲醛溶液中固定后常規(guī)石蠟包埋并切片待檢。

1.4ELISA檢測 按照ELISA試劑盒方法檢測NF-κB及TNF-α水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀況比較 對照組：大鼠活動自如，毛發(fā)光澤，反應(yīng)機敏，未見便血，食欲可，體重稍有增加；模型組：大鼠精神萎靡、懶動，毛發(fā)無光澤，進食差，消瘦，腹瀉、溏便、膿血便；莎爾福組：大鼠狀況逐漸好轉(zhuǎn)，溏便、膿血便稍有緩解，進食量漸增，體重稍有恢復(fù)；億活組：大鼠狀況好轉(zhuǎn)，溏便、膿血便明顯減輕，進食量逐漸增加，體重恢復(fù)；聯(lián)合治療組：大鼠活動、毛發(fā)、飲食、溏便、膿血便明顯改善，體重稍有增加。

2.2各組NF-κB與TNF-α水平變化比較 與對照組比較，模型組、莎爾福組、億活組NF-κB及TNF-α水平均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，莎爾福組、億活組、聯(lián)合治療組NF-κB及TNF-α水平顯著降低(均P<0.05)。莎爾福組及億活組NF-κB、TNF-α水平均顯著高于聯(lián)合治療組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組NF-κB及TNF-α水平變化比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與聯(lián)合治療組比較：3)P<0.05

3 討 論

NF-κB在細胞因子的釋放與轉(zhuǎn)錄過程中起重要調(diào)控作用，NF-κB處于炎癥調(diào)節(jié)的中樞，活化的NF-κB導(dǎo)致細胞因子表達增加從而引起腸道炎癥反應(yīng)，致使結(jié)腸黏膜損傷。NF-κB通過調(diào)控環(huán)氧合酶(COX)-2表達介導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔3〕。TNF-α具有直接殺傷或抑制腫瘤細胞的作用，TNF-α主要通過促進釋放血小板活化因子生成氧自由基和白三烯，促進分泌蛋白酶與刺激前列腺素E2的釋放及誘導(dǎo)一氧化氮合成，上調(diào)T淋巴細胞與嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞數(shù)目引起腸黏膜損傷〔4〕。

本研究表明NF-κB在UC的發(fā)病中起重要作用，能夠引起腸道炎癥，NF-κB能夠調(diào)節(jié)各種炎癥因子與細胞因子及趨化因子轉(zhuǎn)錄因子的水平，NF-κB水平升高導(dǎo)致細胞因子表達增加從而引起腸道炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸黏膜損傷；TNF-α水平升高，促進氧自由基和白三烯的生成，進一步加重了腸黏膜損傷，導(dǎo)致黏膜充血，水腫及糜爛。

菌群紊亂引起腸道固有免疫異常激活可致UC，腸道黏膜完整性的破壞及細菌屏障功能紊亂在UC患者中表現(xiàn)尤為明顯。有研究學(xué)者提出用益生菌及其產(chǎn)物來治療UC取得了一定的臨床治療效果〔5〕。更有學(xué)者提出糞菌移植治療炎癥性腸病〔6〕。

本研究結(jié)果證實億活和莎爾福對UC治療均有效，兩藥聯(lián)合治療效果較單藥治療效果更優(yōu)。綜合分析億活對UC的治療作用機制可能有以下幾種：① 抑制病原微生物生長，提高定植抗力，致病菌定植遭阻止。②通過布拉菌分泌的蛋白酶可水解由梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的毒素，促進修復(fù)損傷上皮，上皮緊密連接增強，腸黏膜屏障穩(wěn)定，細菌移位阻止。③調(diào)節(jié)抗炎與促炎因子平衡，促進腸道恢復(fù)免疫功能。