大豆肽通過抑制氧化應(yīng)激和NF-κB信號(hào)通路保護(hù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟功能

謝永磊 徐宛玲 黃亞男 李盤欣 馬永超 崔明辰

(1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 河南省腫瘤發(fā)生與防治創(chuàng)新型科技團(tuán)隊(duì)，河南 漯河 462002；2河南省南街村(集團(tuán))有限公司)

力竭運(yùn)動(dòng)是指機(jī)體在疲勞的基礎(chǔ)上持續(xù)超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，直至精疲力竭不能再活動(dòng)，是一種超強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)〔1〕。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體的供氧相對不足，使氧自由基、氧化代謝產(chǎn)物等損傷因子增多，對腦、心臟、肝臟、腎臟等重要器官均可造成不同程度的損傷，特別是長期多次力竭運(yùn)動(dòng)還會(huì)導(dǎo)致器官組織不可逆器質(zhì)性病變，誘發(fā)器官衰竭甚至死亡〔2,3〕。研究報(bào)道，力竭運(yùn)動(dòng)后心肌的變化與心臟缺血再灌注損傷病變類似，各種損傷因子(氧自由基、炎性因子等)可激活核因子(NF)-κB信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重心肌損傷〔4～6〕。大豆肽是由大豆經(jīng)微生物酵解或酶解而得到的短鏈小分子肽混合物，相對分子量為500～3 000 D，具有調(diào)節(jié)免疫、緩解疲勞、促進(jìn)肌肉增長、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等功效〔7～10〕。本研究采用強(qiáng)迫游泳法建立大鼠力竭運(yùn)動(dòng)動(dòng)物模型，同時(shí)給予大豆肽進(jìn)行干預(yù)，觀察其對力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟功能的保護(hù)作用，并以NF-κB分子信號(hào)通路為靶點(diǎn)，探討其保護(hù)力竭運(yùn)動(dòng)后心臟功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 大豆肽，分子量為500～2 500 D，由河南省南街村(集團(tuán))有限公司提供；戊巴比妥鈉，貨號(hào)：P3761，購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)及CK同工酶(CK-MB)檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；NF-κB、NF-κB抑制蛋白激酶(IKK)-β、NF-κB抑制蛋白(IκB)-α 及β-actin抗體(兔抗)由美國Affinity Bioscience(艾菲)公司提供；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)快速配制試劑盒、BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～170 kD)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、BeyoECL Plus 超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BeyoRTTMⅡ M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、BeyoRTTMⅡ cDNA第一鏈合成試劑盒及Trizol 總RNA抽提試劑等，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。L5紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；FA1004電子分析天平，上海光學(xué)儀器廠；DW-86L578J超低溫冰箱，海爾生物醫(yī)療設(shè)備有限公司；H1850高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T100TM PCR儀、Mini-PROTEAN?Tetra 垂直電泳槽、Sub-Cell GT 水平電泳槽、ChemiDocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)等，均購自美國Bio-Rad公司。

1.2動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK(湘)2014-0006。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只，調(diào)整動(dòng)物房溫度為20℃～25℃，濕度50%～70%，12 h/12 h光照周期，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進(jìn)行游泳訓(xùn)練初篩，剔除游泳較差(<5 min)或不會(huì)游泳的大鼠。將篩選后的50只大鼠分為正常對照組、力竭運(yùn)動(dòng)組及大豆肽高、中、低組(力竭運(yùn)動(dòng)+大豆肽500、250及125 mg/kg)，每組10只，正常對照組及力竭運(yùn)動(dòng)組灌胃蒸餾水、大豆肽組分別灌胃不同劑量的大豆肽，給藥容量均為0.1 ml/100 g，每次于游泳前2 h灌服，連續(xù)4 w。

1.3力竭運(yùn)動(dòng)大鼠模型的制備〔11〕將大鼠置于一圓形游泳水桶里(高60 cm、直徑100 cm)，水深50 cm，調(diào)整水溫為30℃～35℃。正常對照組正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行游泳訓(xùn)練；力竭運(yùn)動(dòng)組和大豆肽組大鼠尾部負(fù)重體重5%鉛絲，放入水中游泳直至力竭，每周5次，周二、周六休息，持續(xù)4 w。力竭運(yùn)動(dòng)判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在水中游泳直至不能再動(dòng)，并整體沉入水中10 s不能上浮。末次力竭運(yùn)動(dòng)后，將大鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，檢測SOD、MDA、GSH-Px、CAT、LDH、CK及CK-MB；取大鼠心肌組織采用RT-PCR和Western印跡法檢測NF-κB、IKK-β及IκB-α 等因子的表達(dá)水平。

1.4RT-PCR法檢測大鼠心肌組織NF-κB、IKK-β及IκB-α mRNA表達(dá)水平 取大鼠心肌組織約50 mg，置于研缽中，迅速加適量液氮，充分研磨直至變?yōu)榉勰?，然后將勻漿移入EP管中，按照Trizol 總RNA抽提試劑操作流程提取RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所需引物序列如下，NF-κB上游引物：5′-CTGGCCATGGACGATCTGTT-3′，下游引物：5′-TGATCTTGATGGTGGGGTGC-3′，產(chǎn)物196 bp；IKK-β上游引物：5′-GGCACCCAATGATTTGCCTC-3′，下游引物：5′-CGCTCTTCTGCCGGACTTTA-3′，產(chǎn)物461 bp；IκB-α上游引物：5′-CTGTTGAAGTGTGGGGCTGA-3′，下游引物：5′-ACACACAGTCATCGTAGGGC-3′，產(chǎn)物214 bp；β-actin上游引物：5′-AACACCCCAGCCATGTACG-3′，下游引物：5′-ATGAGGGAGCGCGTAACC-3′，產(chǎn)物138 bp。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 35 s，58℃ 30 s，70℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下成像，讀取條帶光密度值并分析 NF-κB、IKK-β及IκB-α mRNA 的相對表達(dá)值。

1.5Western印跡法檢測大鼠心肌組織NF-κB p65、IKK-β及IκB-α 蛋白表達(dá)水平 取大鼠心臟組織約100 mg，置于2 ml勻漿器中，加入0.5 ml RIPA裂解液充分研磨直至組織完全碎裂，充分反應(yīng)30 min后移入1.5 ml 離心管中，于4℃下15 000 r/min離心10 min，得上清即為蛋白提取液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量并調(diào)整各樣本蛋白濃度一致，然后進(jìn)行蛋白電泳，按照Western印跡操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育及顯影，以NF-κB、IKK-β及IκB-α蛋白條帶與 β-actin 條帶之比進(jìn)行半定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析法。

2 結(jié) 果

2.1大豆肽預(yù)處理對力竭運(yùn)動(dòng)大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px及CAT水平的影響 與正常對照組比較，力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠血清SOD、GSH-Px及CAT活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)。與力竭運(yùn)動(dòng)組比較，大豆肽高組SOD、GSH-Px及CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.01)；大豆肽中組SOD、GSH-Px活性顯著升高，MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2大豆肽預(yù)處理對力竭運(yùn)動(dòng)大鼠血清LDH、CK及CK-MB活性的影響 與正常對照組比較，力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠血清LDH、CK及CK-MB活性顯著升高(P<0.01)。與力竭運(yùn)動(dòng)組比較，大豆肽高、中組LDH、CK及CK-MB活性顯著降低(P<0.05，P<0.01)；大豆肽低組CK活性顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組SOD、MDA、GSH-Px、CAT水平及LDH、CK及CK-MB活性比較

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;與力竭運(yùn)動(dòng)組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.3大豆肽預(yù)處理對力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織NF-κB、IKK-β及IκB-α mRNA表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，力竭運(yùn)動(dòng)組NF-κB、IKK-β mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，IκB-α mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)。與力竭運(yùn)動(dòng)組比較，大豆肽高組NF-κB、IKK-β mRNA表達(dá)水平顯著降低，IκB-α mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.4大豆肽預(yù)處理對力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織NF-κB、IKK-β及IκB-α 蛋白表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，力竭運(yùn)動(dòng)組NF-κB、IKK-β 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，IκB-α 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)。與力竭運(yùn)動(dòng)組比較，大豆肽高組NF-κB、IKK-β 蛋白表達(dá)水平顯著降低，IκB-α 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 各組NF-κB、IKK-β及IκB-α mRNA表達(dá)水平比較

表3 各組NF-κB、IKK-β及IκB-α蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

適度運(yùn)動(dòng)可以增加機(jī)體的耐力和適應(yīng)能力，達(dá)到強(qiáng)身健體的作用。但如果長時(shí)間超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，特別是力竭運(yùn)動(dòng)，勢必會(huì)對機(jī)體造成不同程度的損傷。在力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于持續(xù)運(yùn)動(dòng)超過了機(jī)體所能承受的運(yùn)動(dòng)能力，導(dǎo)致機(jī)體缺血缺氧，從而引發(fā)病理性損傷〔12〕。心臟是機(jī)體的重要供血器官，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌缺血缺氧會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的心功能障礙和心肌損傷，繼之誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)心律失常、暈厥，甚至出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性猝死等，因此對于力竭運(yùn)動(dòng)心臟損傷的防治就顯得尤為重要〔13〕。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體無法滿足心臟對血、氧的需求，使心肌細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)物增多，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，通透性增加，心肌細(xì)胞內(nèi)LDH、CK及CK-MB等心肌酶釋放進(jìn)入血液，故檢測血液中心肌酶含量可間接反映心肌缺血缺氧和損傷程度〔14,15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠血清LDH、CK及CK-MB含量明顯增高，提示力竭運(yùn)動(dòng)對心臟有一定的損害作用，這與以往的研究〔16〕報(bào)道一致。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)大豆肽可明顯降低力竭運(yùn)動(dòng)大鼠血清LDH、CK及CK-MB含量，提示其對力竭運(yùn)動(dòng)心臟損傷有較好的保護(hù)作用。

研究報(bào)道〔17,18〕，由于力竭運(yùn)動(dòng)使機(jī)體持續(xù)處于缺血缺氧狀態(tài)，引發(fā)過氧化應(yīng)激反應(yīng)，可產(chǎn)生大量的自由基，特別是氧自由基，從而導(dǎo)致SOD、GSH-Px及CAT等抗氧化酶清除自由基的能力降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA等)增多，損傷心肌等重要器官組織，所以抗氧化劑是預(yù)防對力竭運(yùn)動(dòng)氧化損傷的重要手段之一。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)持續(xù)的過氧化應(yīng)激亦可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。NF-κB信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥信號(hào)通路，其主要有上下游IKK-β及IκB-α 等分子組成。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB兩個(gè)亞基(P65和P50)與IκB-α結(jié)合在一起，以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)在外界炎癥因子或氧化因子的刺激作用下，IKK-β被激活并磷酸化，然后與NF-κB-IκB-α二聚體結(jié)合，使IκB-α降解，失去抑制NF-κB活性的作用，NF-κB得以游離，游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核內(nèi)，與其特異DNA序列結(jié)合，促發(fā)相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔19～21〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆肽可明顯增加力竭運(yùn)動(dòng)大鼠血清SOD、GSH-Px及CAT含量，降低MDA濃度；大豆肽可顯著下調(diào)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織NF-κB、IKK-β mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)IκB-αmRNA和蛋白表達(dá)水平，提示大豆肽保護(hù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟與其抗氧化應(yīng)激和抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。