內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在壓力性負(fù)荷高血壓大鼠血管重構(gòu)中的作用

顧靜 趙英 李海龍 郭超 吳紅彥 鐘靈 李龍 張正富 董轉(zhuǎn)麗 代潤(rùn)景 鞏璐

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 )

高血壓是病因機(jī)制復(fù)雜交錯(cuò)的心血管綜合征，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴隨著血管結(jié)構(gòu)的改變，但具體機(jī)制不清。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是一種亞細(xì)胞層面的反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用，早期適度的 ERS 可誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)分子伴侶如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78和GRP94、鈣網(wǎng)蛋白(CRT)等，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的恢復(fù)〔1〕，具有細(xì)胞保護(hù)作用；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)強(qiáng)的ERS通過(guò)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)分子CHOP的表達(dá)和caspase-12的活化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔2，3〕。但ERS是否影響高血壓發(fā)生發(fā)展中血管結(jié)構(gòu)的變化鮮有報(bào)道。本研究檢測(cè)ERS的保護(hù)性和促凋亡分子在血壓發(fā)展不同時(shí)期的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)凋亡情況。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物、試劑 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠90只，體重(200±10)g，來(lái)源于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。大鼠GAPDH、GRP78和CHOP等抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；TUNEL 熒光檢測(cè)凋亡試劑盒、RIPA裂解液、Tween-20、PMSF、TRIS等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛購(gòu)自天津科化。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腹主動(dòng)脈狹窄術(shù)建立高血壓大鼠模型〔4，5〕術(shù)前禁食，水合氯醛麻醉，仰臥位固定，無(wú)菌消毒。肋弓下緣0.5 cm、腹正中線旁左側(cè)0.5 cm處行2.0～2.5 cm 縱行切口，逐層分離組織穿透腹膜進(jìn)入腹腔，鈍性分離并縮窄腹主動(dòng)脈〔4〕，緩慢抽離針頭，防止損傷血管，逐層縫合傷口并消毒。假手術(shù)組僅分離腹主動(dòng)脈。術(shù)后肌注頭孢噻吩鈉預(yù)防感染。

1.2.2動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)(對(duì)照)組和手術(shù)(模型)組，按術(shù)后時(shí)間兩組又分為 1 w、2 w、4 w、6 w 4個(gè)亞組(各亞組10～12只動(dòng)物)。

1.2.3鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓法〔6〕測(cè)量血壓及動(dòng)脈血管標(biāo)本的采集 各亞組按照相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行血壓監(jiān)測(cè)，采用無(wú)創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓系統(tǒng)監(jiān)測(cè)清醒動(dòng)物血壓，測(cè)3次，取其均值〔4，6〕。然后用10%水合氯醛麻醉大鼠，開胸沿心臟分離出主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈，截取1～2 cm長(zhǎng)的主動(dòng)脈并分成兩段，一段存入-80℃冰箱備用，另一段多聚甲醛固定備用。

1.2.4病理切片及免疫組化 石蠟包埋組織行常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下(400倍)觀察血管壁中層平滑肌層的結(jié)構(gòu)變化，并按照說(shuō)明書進(jìn)行PV兩步法免疫組化染色。使用光學(xué)顯微鏡照相記錄圖片，用圖像分析系統(tǒng)分析并計(jì)算平均光密度。

1.2.5血管肌層厚度的測(cè)量 常規(guī)制備主動(dòng)脈血管的病理切片。從每個(gè)亞組的切片中隨機(jī)選取8張，每張切片顯微鏡下隨機(jī)選取 3個(gè)視野，利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)選取的視野進(jìn)行分析測(cè)量，對(duì)測(cè)得的主動(dòng)脈血管壁肌層厚度值取平均值〔4〕。

1.2.6VSMC凋亡檢測(cè) 按照TUNEL試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)VSMC凋亡情況。

1.2.7Western印跡 裂解液提取總蛋白，然后煮沸變性4℃保存。按照普利萊蛋白定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)定量，以BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白562 nm測(cè)量光密度D(λ)值，并對(duì)蛋白濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得出樣本蛋白濃度計(jì)算公式并按照公式計(jì)算蛋白上樣量；行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，加樣、恒流電泳分離蛋白，恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉膜上非特異結(jié)合的蛋白，加一抗孵育、二抗孵育；曝光顯色及圖像分析。由凝膠成像系統(tǒng)采集信號(hào)并利用圖像分析軟件分析目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠血壓變化 術(shù)前，模型組與對(duì)照組血壓比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但術(shù)后1 w、2 w、4 w和6 w，模型組比相應(yīng)觀察時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組血壓分別升高了12.7%、17.4%、30.8%和34.3%(P<0.05，P<0.01)，且對(duì)比本組術(shù)前血壓分別升高了19.6%、25.3%、38.8%和43.4%(均P<0.01)，且有遞增趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)血壓比較

與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與本組術(shù)前比較：3)P<0.01；下表同

2.2大鼠主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組中膜肌層VSMC扁平、胞質(zhì)豐富、層次清楚、內(nèi)膜較完整。模型組早期(2 w)中膜肌層VSMC肥大、核深染，細(xì)胞排列紊亂，彈性纖維間細(xì)胞較疏松，彈性膜彎曲、紊亂；后期(6 w)VSMC核淡染，說(shuō)明細(xì)胞合成代謝功能減弱，細(xì)胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)不清，血管壁表現(xiàn)為明顯的形態(tài)學(xué)重構(gòu)。見(jiàn)圖1。

2.3大鼠主動(dòng)脈血管壁肌層厚度變化 術(shù)前，模型組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但術(shù)后1 w、2 w、4 w和6 w與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，模型組血管壁肌層厚度分別升高了2.7%、6.6%、20.0%和24.3%(P<0.05，

P<0.01)，且模型組術(shù)后1 w、2 w、4 w、6 w比術(shù)前分別增厚了2.5%、7.7%、19.9%和25.0%(均P<0.01)，且有遞增趨勢(shì)(見(jiàn)表2)。提示高血壓大鼠血管重構(gòu)明顯。

圖1 大鼠腹主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變(HE,×400)

組別術(shù)前術(shù)后1 w術(shù)后2 w術(shù)后4 w術(shù)后6 w對(duì)照組92.04±8.3292.30±7.6393.45±10.2392.43±8.3493.00±6.70模型組92.50±8.1294.82±6.8999.58±10.271)3)110.95±8.982)3)115.62±12.312)3)

2.4大鼠主動(dòng)脈GRP78和CHOP免疫組化染色 術(shù)后6 w，GRP78和CHOP免疫組化染色觀察顯示：細(xì)胞質(zhì)被染成棕色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，模型組腹主動(dòng)脈中膜肌層GRP78(0.094±0.041)和CHOP(0.135±0.027)表達(dá)較對(duì)照組(0.064±0.023，0.073±0.035)增多(P<0.05)，尤其是CHOP表達(dá)顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 GRP78免疫組化染色(×400)

圖3 CHOP免疫組化染色(×400)

2.5大鼠主動(dòng)脈血管組織中GRP78表達(dá)變化 術(shù)前，模型組與對(duì)照組GRP78表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后1 w、2 w，模型組比相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組GRP78表達(dá)顯著增高(均P<0.01)，4 w、6 w時(shí)GRP78表達(dá)有所下降，與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后1 w、2 w，模型組比術(shù)前GRP78表達(dá)明顯升高(均P<0.01)，術(shù)后4 w GRP78表達(dá)與術(shù)前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，6 w時(shí)比術(shù)前明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖4，表3。

2.6大鼠主動(dòng)脈血管組織中CHOP表達(dá)變化 模型組CHOP的表達(dá)在術(shù)后1 w時(shí)比對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，但隨著時(shí)間推遲有明顯的增高趨勢(shì)，2 w、4 w和6 w對(duì)比相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組明顯升高(P<0.05，P<0.01)。模型組術(shù)后1 w對(duì)比術(shù)前CHOP表達(dá)稍有降低(P>0.05)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后2 w、4 w、6 w時(shí)對(duì)比明顯術(shù)前升高(均P<0.01)。見(jiàn)圖4，表4。

2.7大鼠動(dòng)脈VSMC凋亡檢測(cè) 術(shù)前，模型組與對(duì)照組VSMC凋亡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但術(shù)后1 w、2 w、4 w和6 w，對(duì)比相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組，模型組VSMC的凋亡率明顯升高(P<0.05，P<0.01)；模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)比術(shù)前也明顯升高(均P<0.01)。見(jiàn)表5。

圖4 大鼠主動(dòng)脈血管組織中GRP>8、CHOP表達(dá)的變化

組別術(shù)前術(shù)后1 w術(shù)后2 w術(shù)后4 w術(shù)后6 w對(duì)照組0.123±0.0230.106±0.0320.144±0.0150.137±0.0130.135±0.018模型組0.136±0.0150.289±0.0212)3)0.264±0.0242)3)0.128±0.0200.156±0.0303)

表4 大鼠主動(dòng)脈血管組織中CHOP表達(dá)變化值)

表5 大鼠主動(dòng)脈VSMC凋亡率的變化

3 討 論

本研究證明高血壓發(fā)生發(fā)展的中早期即伴有大動(dòng)脈血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，這種血管壁肌層增厚的重構(gòu)效應(yīng)必然引起血管收縮舒張功能改變，進(jìn)而影響動(dòng)脈血壓的周期性變化。更重要的是，動(dòng)脈血管壁肌層增厚的同時(shí)一定伴有血管腔內(nèi)徑減小的變化，這直接造成血管系統(tǒng)容積減小。在血壓的影響因素中，血管平均充盈壓(血量/血管容積)直接決定著血壓的高低，因此實(shí)驗(yàn)中血管壁增厚、管腔容積變小造成的充盈壓升高可能是引起血壓增高的又一原因。

許多心腦血管疾病都與ERS有關(guān)，ERS早期促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)，而過(guò)強(qiáng)晚期的應(yīng)激可誘導(dǎo)凋亡、破壞清除受損細(xì)胞〔2，3，7〕。在非ERS條件下，GRP78能結(jié)合三條ERS信號(hào)通路激活的關(guān)鍵分子——雙鏈RNA激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)〔 8〕、抑制物阻抗性酯酶(IRE)1〔9〕和活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)6〔9〕的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)端，抑制信號(hào)分子活化，而應(yīng)激時(shí)它們解離活化，GRP78是ERS激活的起始調(diào)控因子〔10〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，在高血壓發(fā)生的起始階段ERS就被激活，GRP78作為功能恢復(fù)性因子能調(diào)節(jié)ER，促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)，增強(qiáng)細(xì)胞耐受刺激。但是隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，ERS對(duì)VSMC的保護(hù)作用減弱，相應(yīng)的VSMC凋亡率在 1、2 w時(shí)比對(duì)照組雖然有升高，但較4、6 w時(shí)增幅較小(早期細(xì)胞凋亡率輕度增加可能與腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)本身的手術(shù)創(chuàng)傷有一定關(guān)系)，進(jìn)一步說(shuō)明在高血壓發(fā)生的早期，ERS的保護(hù)因子GRP78可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，保護(hù)VSMC減輕損傷。但Rizzoni等〔11〕研究認(rèn)為，雖然VSMC凋亡率在早期沒(méi)有顯著增加，但是血管壁中層厚度仍然明顯增加，這可能與VSMC的增殖和與之相平衡的凋亡活動(dòng)調(diào)節(jié)異常有關(guān)。

上述ERS的三條信號(hào)通路最后都會(huì)激活CHOP——ERS誘導(dǎo)凋亡的中心調(diào)解因子。在持續(xù)和嚴(yán)重的應(yīng)激時(shí)，ER功能無(wú)法復(fù)原，CHOP開始介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔10〕。CHOP 又稱DNA損傷誘導(dǎo)基因(GADD)153，其功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的凋亡有關(guān)。正常情況下，CHOP表達(dá)相對(duì)較低；當(dāng)ERS時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)非折疊蛋白水平升高，IRE1α和IRE1β、ATF6 及PERK活化，使其胞質(zhì)部分進(jìn)入核內(nèi)，啟動(dòng)CHOP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，CHOP作為轉(zhuǎn)錄因子會(huì)調(diào)節(jié)大量的促凋亡和抑凋亡因子的表達(dá)(如Bcl-2和GADD34)，可見(jiàn)CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)凋亡的重要因子。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了李煒〔4〕的研究：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ERS促修復(fù)能力下降，促凋亡途徑開始起主導(dǎo)作用，相應(yīng)的VSMC凋亡率在4、6 w時(shí)顯著增加?；庇碌取?2〕報(bào)道了鈣通道阻滯劑可改善ERS，抑制壓力過(guò)負(fù)荷高血壓大鼠的心肌重構(gòu)，而本研究證明ERS還參與了壓力性負(fù)荷高血壓大鼠的血管重構(gòu)。

綜上，壓力性負(fù)荷所致的高血壓發(fā)生早期，ERS保護(hù)性因子GRP78占主導(dǎo)地位，但VSMC的凋亡已經(jīng)開始，動(dòng)脈管壁平滑肌層厚度也已經(jīng)開始增加。隨著應(yīng)激的持續(xù)發(fā)展，由CHOP調(diào)控的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的凋亡開始發(fā)揮主要作用，VSMC凋亡率和主動(dòng)脈管壁厚度增加?？梢?jiàn)，ERS的雙向調(diào)節(jié)作用參與高血壓血管重構(gòu)。