低劑量促紅細(xì)胞生成素對大鼠腎移植物急性炎癥反應(yīng)的影響

徐鑫梅 譚州科 楊亦彬 容松

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1臨床技能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，貴州 遵義 563000；2腎內(nèi)科；3遵義醫(yī)學(xué)院器官移植中心)

腎移植是終末期腎病患者首選治療方案，但腎移植后的免疫排斥反應(yīng)和缺血再灌注損傷(IRI)可導(dǎo)致腎移植物損傷，其損傷過程大多通過炎癥細(xì)胞浸潤移植物及炎性因子釋放等引發(fā)的炎癥反應(yīng)完成，可顯著影響腎移植物功能恢復(fù)甚至喪失腎功能，從而嚴(yán)重影響腎移植物的中遠(yuǎn)期存活率。因此，提高腎移植物長期存活率仍是目前臨床面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)〔1～3〕。

促紅細(xì)胞生成素(EPO)主要在腎臟合成，除了造血功能外，還具有多效性保護(hù)作用，主要有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗凋亡、促進(jìn)血管新生及減輕纖維化等作用〔4,5〕。腎移植過程中不可避免發(fā)生缺血再灌注損傷(IRI)。本實(shí)驗(yàn)擬探討低劑量EPO對大鼠腎移植物急性炎癥反應(yīng)的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物模型及標(biāo)本 清潔級健康雄性Lewis大鼠6周齡，體重150～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2006-0008。隨機(jī)分為假手術(shù)組、腎移植模型組、EPO給藥組，每組10只。腎移植模型組及EPO給藥組做單側(cè)腎移植模型，假手術(shù)組僅分離左側(cè)腎蒂不做腎移植手術(shù)，并去除右腎。假手術(shù)組、腎移植模型組術(shù)前1 d均注射等體積生理鹽水；EPO給藥組術(shù)前1 d及術(shù)前當(dāng)天皮下注射人重組EPO(rHuEPO)300 μg/kg。術(shù)后24 h處死各組大鼠，取移植腎并分成3份：1份放入甲醛中保存，24 h后石蠟包埋，用于病理染色；2份放入液氮中快速冷凍后-80℃保存，用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.2大鼠腎組織病理學(xué)檢查 通過PAS染色觀察腎組織病理變化，于400倍鏡下采集染色圖像，每張切片采集10個(gè)不重復(fù)視野，觀察各組大鼠腎組織損傷情況。

1.3免疫組織化學(xué)方法檢測腎組織中單核/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物(ED)-1、 誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達(dá) 各組大鼠腎組織切片應(yīng)用德國萊卡IPWin32采圖系統(tǒng)進(jìn)行采集，每張切片隨機(jī)采集10個(gè)視野。以Image-proplus6.0為工具，以平均積分光密度(AIOD)為指標(biāo)進(jìn)行半定量分析。AIOD即平均光密度的乘積與陽性表達(dá)面積的均值，其大小既反映免疫組化陽性部分的強(qiáng)度又可反映陽性部分的面積，可以比較真實(shí)反映抗原的半定量數(shù)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1腎臟病理改變 腎移植模型組腎小管管腔擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見脫落的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯；EPO給藥組腎小管管腔擴(kuò)張、管腔內(nèi)碎片脫落、腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯減輕；假手術(shù)組基本正常。見圖1。

圖1 各組腎組織病理變化(PAS染色，×400)

2.2腎組織中ED-1表達(dá) ED-1主要表達(dá)于腎間質(zhì)，EPO給藥組與腎移植模型組相比，ED-1炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(P<0.01)，但EPO給藥組和腎移植模型組均高于假手術(shù)組(P<0.01)。見圖2，表1。

圖2 各組腎組織中ED-1表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)

2.3腎組織中iNOS表達(dá) iNOS主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，腎移植模型組明顯高于EPO給藥組(P<0.01)，而EPO給藥組和腎移植模型組均高于假手術(shù)組(P<0.01)。見圖3，表1。

圖3 各組腎組織中iNOS表達(dá)(免疫組織化學(xué),×400)

2.4腎組織中Caspase-3表達(dá) Caspase-3主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，EPO給藥組Caspase-3表達(dá)較腎移植模型組明顯減少(P<0.01)，而EPO給藥組和腎移植模型組均高于假手術(shù)組(P<0.01)。見圖4，表1。

圖4 各組腎組織中Caspase-3表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)

組別ED-1iNOSCaspase-3腎移植模型組19.56±5.912)28.95±5.832)12.89±2.992)EPO給藥組7.88±1.681)2)10.39±2.011)2)5.85±1.171)2)假手術(shù)組2.89±0.981)6.06±0.841)1.45±0.881)

與腎移植模型組比較：1)P<0.01;與假手術(shù)組比較：2)P<0.01

3 討 論

腎移植后一旦發(fā)生IRI，可立即啟動炎癥反應(yīng)。當(dāng)氧供不足及再次供氧時(shí)，由于糖原缺乏、腺苷三磷酸耗竭、活性氧及氧自由基的產(chǎn)生等，均會導(dǎo)致分子代謝變化，分子代謝變化又可導(dǎo)致各種細(xì)胞、因子發(fā)生變化，因此腎移植后的IRI正是由于細(xì)胞、因子的變化而引發(fā)的炎癥反應(yīng)〔6，7〕。這些細(xì)胞、因子的變化可能有：(1)炎癥細(xì)胞活化、浸潤：炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等被活化，活化后的炎癥細(xì)胞可釋放炎性因子、趨化因子、氧自由基等，而炎性因子、趨化因子、氧自由基又可再反作用于炎癥細(xì)胞，使炎癥細(xì)胞進(jìn)一步遷移、浸潤到組織受損區(qū)，而在IRI 早期階段(再灌注后24 h內(nèi))浸潤的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出了促炎作用〔8～11〕。(2)氧化作用：IRI時(shí)，iNOS表達(dá)增多，iNOS來源的NO生成增多，而且iNOS來源的NO具有損傷性，損傷性NO可與活性氧自由基反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽，過氧亞硝酸鹽可引起細(xì)胞膜過氧化，抑制蛋白質(zhì)功能，破壞核酸及染色體，對組織細(xì)胞造成傷害，甚至凋亡。iNOS 被認(rèn)為是炎癥介質(zhì)之一，又可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和浸潤、其他炎性因子、趨化因子等的釋放，在炎癥反應(yīng)中具有重要的細(xì)胞毒作用〔12，13〕。(3)細(xì)胞凋亡：IRI時(shí)，鈣超載及線粒體功能障礙、氧自由基的生成等，誘導(dǎo)及調(diào)控細(xì)胞凋亡基因(如Caspase蛋白酶)的表達(dá)，其中Caspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中最重要的凋亡蛋白酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔14，15〕。炎癥反應(yīng)的各個(gè)因素不是孤立、單向性的，而是互相作用形成復(fù)雜的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)及不斷擴(kuò)展的級聯(lián)連鎖反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎移植模型發(fā)生明顯的炎癥細(xì)胞浸潤、氧化，趨化因子釋放，細(xì)胞凋亡等。

EPO是一種34 kD糖蛋白激素樣物質(zhì)，可促進(jìn)紅細(xì)胞生成，臨床上廣泛用于治療貧血〔16〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPO還具有多種保護(hù)性作用，最重要的是 EPO具有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗凋亡等作用〔17〕。Jiang等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷模型中，EPO可減輕腦細(xì)胞凋亡。Rong等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，在心肌IRI模型中，EPO可通過抑制炎癥介質(zhì)的生成及釋放減輕炎癥反應(yīng)對心肌組織的損傷。Zhang等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，EPO可通過減輕炎癥細(xì)胞浸潤、下調(diào)炎性因子及凋亡蛋白的表達(dá)等減輕大鼠腎移植后的炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)采用低劑量EPO干預(yù)，是因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)低劑量EPO與高劑量EPO同樣發(fā)揮組織器官保護(hù)作用，而高劑量EPO可造成血栓形成、紅細(xì)胞數(shù)增多等不良反應(yīng)〔21〕。本研究結(jié)果顯示，低劑量EPO干預(yù)后，腎移植后急性炎癥反應(yīng)明顯減輕，腎小管上皮細(xì)胞壞死、空泡狀變性明顯改善，ED-1、iNOS、Caspase-3的表達(dá)水平均明顯降低，說明EPO可減輕腎移植后的炎癥反應(yīng)，其可能通過減少炎癥細(xì)胞的浸潤、細(xì)胞因子的釋放，抗氧化、抑制凋亡等作用，減輕大鼠腎移植后炎癥反應(yīng)對腎移植物的損傷，從而發(fā)揮保護(hù)大鼠移植腎功能的作用。