豬鮮精17℃保存劑效果對比試驗(yàn)

劉鑫 崔茂盛 張丹 唐佩娟 付永利 張學(xué)煒 李千軍*

（1，天津市畜牧獸醫(yī)研究所300381；2，天津農(nóng)學(xué)院300380；3，天津市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心300402；4，天津市畜牧總站300402）

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展與種豬聯(lián)合育種工作的需要，人工授精的普及，豬精液品質(zhì)的控制及精液保存稀釋劑日趨成為豬人工授精技術(shù)的核心[1]。就鮮精保存而言，我國大、中型養(yǎng)豬企業(yè)人工輸精所用精液大多來自當(dāng)天采集，或來自17℃存儲(chǔ)1～2d的精液，如此短的精液存儲(chǔ)時(shí)間必將給企業(yè)增加人力、物力和財(cái)力負(fù)擔(dān)，而且豬場用的17℃恒溫箱的溫度極不穩(wěn)定，給精液存儲(chǔ)質(zhì)量造成較大影響。隨著我國生豬市場集約化和規(guī)模化發(fā)展，豬精液高效、長期保存技術(shù)越發(fā)重要。目前市場上價(jià)格稍低的豬鮮精17℃保存稀釋劑，保存效果大都不穩(wěn)定（2～5d 不等），而質(zhì)量稍高的17℃保存稀釋劑價(jià)格都偏高（14～20 元不等），給生豬養(yǎng)殖企業(yè)帶來較重運(yùn)行成本。因此，探索和研發(fā)成本低的高倍長效精液17℃保存稀釋劑對生豬產(chǎn)業(yè)健康、快速發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：海藻多糖、果糖（上海源葉生物科技有限公司）、葡萄糖（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、青霉素、鏈霉素（山東魯抗舍里樂藥品有限公司）、碳酸氫鈉、EDTA 等（sigma中國有限公司）、精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

主要儀器設(shè)備：CASA 計(jì)算機(jī)自動(dòng)輔助分析系統(tǒng)，相差顯微鏡（英國）、冰箱（河南新飛電器有限公司）、電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 精液保存劑的配制

試驗(yàn)組的藥品為本課題組配制，兩個(gè)對照組（對照一和對照二） 均為國內(nèi)著名品牌，按照產(chǎn)品要求進(jìn)行配制豬精液鮮精保存液。

1.3 精液處理方法

1.3.1 精液采集

采用手握法采集精液，將預(yù)熱好的集精杯（35～37℃） 用滅菌濾紙蓋好，收集中間段精液，邊采集邊過濾去除膠狀物。在37℃下用顯微鏡檢查常規(guī)品質(zhì)，精子活力在0.7 以上、無異味、色澤為乳白色的精液，放入保溫瓶采精室備用[2]。

1.3.2 精液稀釋與平衡

精液取回采精室（室溫25℃左右），暗處靜置，測量精液和稀釋液的溫度，確保二者的溫差為0.1～0.3℃。將自制常溫精液保存劑（提前配好） 與對照組均按（保存劑：原精） 2：1 的比例緩慢加入到豬精液中，輕輕上下?lián)u晃，使精液與稀釋液充分接觸，室溫23～25℃下暗處靜置平衡1h；然后置于l7℃恒溫箱中保存，每12h 輕輕搖動(dòng)1 次，防止精子沉淀[3]。

1.3.3 精子質(zhì)量檢測

精子質(zhì)量檢測指為有效保存時(shí)間、總存活時(shí)間和質(zhì)膜完整性[4]，具體操作參考文獻(xiàn)4，有效保存時(shí)間采用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)進(jìn)行檢測，總存活時(shí)間通過目測法進(jìn)行觀察，質(zhì)膜完整性參考文獻(xiàn)4 進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分為3 組，試驗(yàn)組的稀釋液為課題組研發(fā)，對照組均采用國內(nèi)著名品牌配制稀釋液。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，本試驗(yàn)中精子活率大于0.7 保存時(shí)間為有效保存時(shí)間，精子無活性時(shí)保存總時(shí)長為總存活時(shí)間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 進(jìn)行前期處理，然后用SPSS17.0 進(jìn)行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果分析

2.1 豬鮮精17℃常溫保存不同稀釋劑的保存效果

由表1 數(shù)據(jù)可知，課題組研發(fā)的豬精液17℃常溫保存稀釋劑在有效保存時(shí)間和精子總存活時(shí)間方面均顯著高于對照一組稀釋劑，而相對于對照二組，試驗(yàn)組顯著提高了大白種豬精液有效保存時(shí)間和精子總存活時(shí)間（p＜0.05），其余各組差異均不顯著（p＞0.05）。

表1 不同保存劑對豬精液保存時(shí)間的影響

2.2 不同稀釋劑對保存過程中精子質(zhì)膜完整性的影響

由表2 可知，在常溫保存過程中，3種不同稀釋劑在前3d對精子質(zhì)膜完整性均有較好保護(hù)作用，3 組間差異不顯著（p＞0.05）；保存到第5 天，課題組研發(fā)的保存劑和對照二組中精子質(zhì)膜完整性顯著高于對照一組（p＜0.05），但前2 組之間質(zhì)膜完整性無顯著性差異（＞0.05）；保存至第7 天，對照一、對照二和試驗(yàn)組中精子質(zhì)膜完整性分別為49.94±3.08，58.83±2.22，72.86±2.62，精子質(zhì)膜完整性在該3 組之間均存在差異顯著性（p＜0.05）。

表2 不同保存劑對精子質(zhì)膜完整率的影響

3 討論

對照二組的稀釋劑是我國17℃常溫保存稀釋劑市場上知名高端品牌，精液保存效果穩(wěn)定，基本在5～10d，市場占有率較高，但價(jià)格也較昂貴，每升稀釋劑18～22 元。對照一組選擇了中長期稀釋粉，一般保存時(shí)間在5～7d，也具有較高的市場占有率。因此，本試驗(yàn)選用該2 種市場率占有率較高的豬精液17℃常溫保存稀釋劑作為對照組，試驗(yàn)結(jié)果更加客觀。研究表明，課題組自制豬精液常溫保存劑，在精液17℃常溫保存過程中精子有效保存時(shí)間，精子總存活時(shí)間和質(zhì)膜完整性等指標(biāo)，部分顯著高于對照二組，均顯著高于對照一組。在有效保存時(shí)間方面，穩(wěn)定在7～10d，甚至更長，表明本課題研發(fā)的稀釋劑對精子有較好的保護(hù)作用，這可能與本稀釋劑中含有特殊質(zhì)膜穩(wěn)定性成分、較強(qiáng)的緩沖能力物質(zhì)和適當(dāng)?shù)哪芰款愇镔|(zhì)組合有關(guān)。在質(zhì)膜完整性方面，本課題組研發(fā)的稀釋劑對精子質(zhì)膜也具有顯著的穩(wěn)定作用，這可能與本稀釋劑中緩沖物質(zhì)和滲透壓穩(wěn)定性高有關(guān)，避免精子在保存過程中損傷質(zhì)膜，進(jìn)一步提高精子的有效保存時(shí)間和總存活時(shí)間。