PI3K/AKT信號(hào)通路在促進(jìn)口腔鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

趙曉葦，周靜萍，畢于藍(lán)，汪佳穎，于 瑞，王維康，李先振

(皖南醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

口腔鱗癌占頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率第1位[1]，其惡性程度較高，浸潤(rùn)性較強(qiáng)，易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因[2]。晚期口腔鱗癌多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，外科手術(shù)難以完全切除，而且傳統(tǒng)的化療效果也難以滿(mǎn)意。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)已被證明在促進(jìn)原發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用[3]，前期研究結(jié)果顯示：TNF-α可以通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子snail促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[4]，但其過(guò)程中有眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與。

異常激活的PI3K/AKT信號(hào)通路已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PI3K激活的關(guān)鍵因子AKT可以通過(guò)磷酸化作用于其下游靶蛋白Bad、caspase9、mTOR等從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，因此AKT在抗細(xì)胞凋亡中起到重要作用[5]。

多項(xiàng)研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路均可上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子snail的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，該過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，關(guān)于其在口腔鱗癌中的研究相對(duì)較少。我們?cè)诳谇击[癌細(xì)胞系中模擬炎癥微環(huán)境，探究信號(hào)通路抑制劑作用前后關(guān)鍵因子的表達(dá)。觀察PI3K/AKT信號(hào)通路在調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子實(shí)施snail的表達(dá)誘導(dǎo)發(fā)生EMT中的作用，探討口腔鱗癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)記物，并為實(shí)施新的治療策略提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人鱗癌HN4、HN6、CAL27細(xì)胞(ATCC公司)；DMEM-F12培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國(guó))、TNF-α(Peprotech公司，美國(guó))、RealMaster Mix RT-PCR 試劑盒(天根，北京)、PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑(LY294002)、鼠抗AKT(碧云天，上海)、VS-840-KU超凈工作臺(tái)(凈化設(shè)備廠，蘇州)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 人鱗癌HN4、HN6、CAL27細(xì)胞于DMEM-F12完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化鋪板，培養(yǎng)一段時(shí)間待達(dá)到一定密度且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)液12 h，使細(xì)胞同步化生長(zhǎng)。

1.2.2 HN4、HN6、CAL27口腔鱗癌細(xì)胞處理 本實(shí)驗(yàn)主要分為以下3組：對(duì)照組、TNF-α組、LY294002組。對(duì)照組：未加TNF-α、LY294002的HN4、HN6、CAL27口腔鱗癌細(xì)胞；TNF-α組：濃度為10 μg/L的TNF-α分別刺激HN4、HN6、CAL27；LY294002組：濃度為20 μmol/L的LY294002處理細(xì)胞，1 h后加入濃度為10 μg/L的TNF-α繼續(xù)刺激。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot) 取TNF-α組、LY294002組細(xì)胞分別作用一段時(shí)間，并取相應(yīng)對(duì)照組同時(shí)加入蛋白裂解液和PMSF提取細(xì)胞總蛋白。用10%SDS-PAGE凝膠將蛋白進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)印至NC膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%牛奶室溫封閉1 h，加入AKT、P-AKT(Ser473)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1.5 h，加顯影液后放入化學(xué)發(fā)光分析儀中曝光獲取圖像信息，Image lab軟件掃描獲取灰度值，校正內(nèi)參，分析蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR) 取72 h的對(duì)照組、TNF-α組、LY294002組的細(xì)胞，采用Trizol試劑提取各細(xì)胞樣本的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用7500ABI real-time PCR儀，選用β-actin作為內(nèi)參基因，目的基因引物序列如表1所示，上述過(guò)程均按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。采用2-△△CT相對(duì)定量法進(jìn)行組間基因差異表達(dá)比較，獲取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，至少重復(fù)10次，單因素方差分析多組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR所需引物序列

2 結(jié)果

2.1 TNF-α作用前后、LY294002抑制劑作用后口腔鱗癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(圖1) TNF-α作用72 h前后口腔鱗癌細(xì)胞HN4、HN6、CAL27形態(tài)學(xué)變化。典型的鱗狀上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞間連接也變?yōu)樗缮?，間距拉大，形成長(zhǎng)梭狀，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，提示TNF-α作用于口腔鱗癌細(xì)胞后，可能逐漸發(fā)生了EMT的形態(tài)學(xué)改變。

抑制劑(LY294002)與TNF-α聯(lián)合作用72 h后口腔鱗癌細(xì)胞HN4、HN6、CAL27形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為大多數(shù)細(xì)胞仍可見(jiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞拉長(zhǎng)不明顯，細(xì)胞間排列也較為緊密，提示LY294002處理HN4、HN6、CAL27細(xì)胞后，口腔鱗癌細(xì)胞的EMT發(fā)生可能受到一定程度的抑制。

2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)檢測(cè)TNF-α、LY294002作用于口腔鱗癌細(xì)胞，AKT、P-AKT(Ser473)的蛋白表達(dá) 見(jiàn)圖2～4。 TNF-α分別刺激HN4、HN6、CAL27口腔鱗癌細(xì)胞6、12、24、48、72 h后與相應(yīng)對(duì)照組同時(shí)收樣，每組實(shí)驗(yàn)各重復(fù)10次,檢測(cè)TNF-α作用于口腔鱗癌細(xì)胞后AKT、P-AKT的蛋白表達(dá)(圖2A、3A、4A)，結(jié)果如下：發(fā)現(xiàn)TNF-α作用后，PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵因子AKT蛋白表達(dá)上調(diào)，且具有時(shí)間依賴(lài)性(圖2B、3B、4B),HN4(F=25.28,P<0.01)、HN6(F=7.937,P<0.01)、CAL27(F=7.267,P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P-AKT(Ser473)無(wú)明顯變化趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用LY294002處理HN4、HN6、CAL27細(xì)胞，1 h后加入TNF-α繼續(xù)刺激6、12、24、48、72 h后與相應(yīng)對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)各重復(fù)10次,通過(guò)western blot檢測(cè)AKT的蛋白表達(dá)(圖2A、3A、4A)，結(jié)果如下：可見(jiàn)LY294002作用后，AKT表達(dá)無(wú)明顯變化趨勢(shì)，HN4(F=0.3763,P>0.05)、HN6(F=0.1768,P>0.05)、CAL27(F=0.709 2,P>0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05(圖2B、3B、4B)。

1.對(duì)照組;2.6 h;3.12 h;4.24 h;5.48 h;6.72 h;* P<0.05，** P<0.0001。

1.對(duì)照組;2.6 h;3.12 h;4.24 h;5.48 h;6.72 h;* P<0.001，** P<0.0001。

1.對(duì)照組;2.6 h;3.12 h;4.24 h;5.48 h;6.72 h;* P<0.05，** P<0.0001。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)E-鈣黏蛋白表達(dá)情況 在western blot基礎(chǔ)上，TNF-α刺激口腔鱗癌細(xì)胞HN4、HN6、CAL27細(xì)胞72 h，結(jié)果顯示E-鈣黏蛋白的表達(dá)低于對(duì)照組，HN4、HN6、CAL27中分別是相應(yīng)對(duì)照組的0.190倍(P<0.01)、0.182倍(P<0.01)、0.366倍(P<0.01)，提示TNF-α刺激后誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT；而用 LY294002抑制劑處理口腔鱗癌細(xì)胞后，E-鈣黏蛋白表達(dá)均較單純TNF-α刺激升高，HN4、HN6、CAL27比TNF-α組分別相對(duì)升高1.70倍(P<0.01)、2.30倍(P<0.01)、1.30倍(P<0.01)；而低于對(duì)照組，HN4、HN6、CAL27中分別是對(duì)照組的0.325倍(P<0.01)、0.418倍(P<0.01)、0.476倍(P<0.01)，提示通路特異性抑制劑作用后，EMT的發(fā)生受到一定程度的抑制，說(shuō)明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠在一定程度上抑制EMT的發(fā)生(圖5)。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α以及抑制劑作用前后HN4、HN6、CAL27細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)

3 討論

浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致口腔鱗狀細(xì)胞癌生存率低的主要原因，EMT現(xiàn)象的發(fā)生是鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵一步，它使得上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)表型或成纖維樣特性，其主要標(biāo)志是上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白缺失[6]。研究證實(shí)腫瘤微環(huán)境中持續(xù)低劑量的TNF-α可以通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子snail的表達(dá)，促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT[4]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，其由上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，此時(shí)上皮標(biāo)志物丟失，即E-鈣黏蛋白的表達(dá)會(huì)降低，相應(yīng)的間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上升，這種變化會(huì)使細(xì)胞喪失極性，獲得間質(zhì)表型，形態(tài)拉長(zhǎng)似成纖維細(xì)胞，細(xì)胞的黏附力下降，易于突破基底膜向下浸潤(rùn)，向周?chē)斑h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在TNF-α作用后，典型的鱗狀上皮細(xì)胞即鋪路石樣形態(tài)發(fā)生變化，表現(xiàn)為成纖維樣特性，形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，且細(xì)胞間的連接減少，空隙增大；我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在TNF-α作用后，E-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯降低，提示腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生EMT。

AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路的中心調(diào)節(jié)效應(yīng)分子。通路中PI3K和mTOR可分別調(diào)節(jié)Thr308和Ser473這兩個(gè)AKT的磷酸化位點(diǎn)(P-AKT)，當(dāng)兩位點(diǎn)均磷酸化后，則可致AKT被完全活化，繼而激活mTOR，使其下游靶分子4EBP1和p70S6K介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞蛋白合成增加[7]。因此AKT是連接細(xì)胞存活、增殖、凋亡和細(xì)胞代謝途徑的重要節(jié)點(diǎn)[8]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上[9-10]，外源性TNF-α作用于體外培養(yǎng)的口腔鱗癌細(xì)胞，western blot檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路中上述關(guān)鍵因子表達(dá)，結(jié)果顯示AKT蛋白表達(dá)明顯升高，且具有時(shí)間依賴(lài)性。說(shuō)明TNF-α刺激后，PI3K/AKT信號(hào)通路被激活，關(guān)鍵因子AKT表達(dá)上升。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證口腔鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生與PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)系，我們?cè)賾?yīng)用通路特異性抑制劑LY294002與TNF-α聯(lián)合處理。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似，基本保留上皮細(xì)胞形態(tài)；利用western blot檢測(cè)抑制劑作用于口腔鱗癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AKT的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相似，無(wú)明顯變化趨勢(shì)，表明通路抑制劑作用后，AKT表達(dá)下降，PI3K/AKT信號(hào)通路在一定程度上被抑制。同時(shí)我們通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白的表達(dá)均升高，即LY294002作用于口腔鱗癌細(xì)胞后，通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制了炎癥因子TNF-α通過(guò)調(diào)節(jié)snail促進(jìn)EMT發(fā)生的能力，說(shuō)明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可降低口腔鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。但E-鈣黏蛋白的表達(dá)較對(duì)照組仍降低，這可能是由于該基因表達(dá)同時(shí)受多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控，可能有其他信號(hào)通路參與所致，如由于在功能上MAPK與PI3K/AKT信號(hào)通路十分相似，因?yàn)檠芯勘砻魉麄冎g存在一定程度的聯(lián)系。人們發(fā)現(xiàn)MAPK的活性可以被PI3K的抑制劑減弱，比如在幾內(nèi)亞豬嗜中性粒細(xì)胞中,可以部分抑制血小板活化因子誘導(dǎo)激活MAPK的活性；wortmannin(一種PI3K的P110亞基的特異性抑制劑)會(huì)阻斷CD3抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞ERK2的活化及在兔骨骼肌中MAPK的活化。Rane等分別在SB203580(MAPK通路信號(hào)抑制劑)、wortmannin、LY294002存在和不存在的條件下檢測(cè)甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸刺激的嗜中性粒細(xì)胞中的AKT Ser473的磷酸化水平，最終結(jié)果發(fā)現(xiàn),SB203580、wortmannin、LY294002可以抑制AKT磷酸化,說(shuō)明PI3K和MAPK均可以調(diào)節(jié)AKT的活性[11]。或者也可能是通路中存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，以上這些都仍待我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示TNF-α可通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵因子，增強(qiáng)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，而通路特異性抑制劑作用后，TNF-α促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力明顯受到抑制，表明PI3K/AKT信號(hào)通路與口腔鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用密切相關(guān)。我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移并非單一通路所調(diào)控，與其他通路之間的具體相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究，只有對(duì)這些通路更為徹底的研究，并在此基礎(chǔ)上采取特定的措施，才有望完全抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。