化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)在不同年份和不同產(chǎn)地郁金鑒別中的應(yīng)用

李寶輝, 李冬暉, 倪永年

(1.解放軍989醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,河南洛陽(yáng) 471031; 2.南昌大學(xué)化學(xué)系,江西南昌 330031)

中藥以其藥效作用多樣和低毒而聞名,而隨著對(duì)中藥認(rèn)知度的不斷提高和使用,中藥正在走向世界并逐漸為國(guó)內(nèi)外民眾所認(rèn)可。郁金是較早使用的中藥材,并被記錄于蘇敬的《唐本草》,用藥歷史距今已有1 400年。郁金廣泛用于活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、殺菌、抗病毒和抗炎。其主要的兩大活性組分為姜黃素類(lèi)化合物和揮發(fā)油類(lèi)化合物。地域?qū)χ兴幉牡乃幮杂绊懞艽?通常把較其他產(chǎn)區(qū)的同種藥材品質(zhì)更佳、療效更好，并具有較高知名度的藥材稱(chēng)為道地藥材[1]。四川產(chǎn)郁金被稱(chēng)作為郁金的道地藥材,廣西、云南、浙江一帶也都產(chǎn)郁金藥材,但質(zhì)量不如四川產(chǎn)郁金。由于價(jià)格等因素市場(chǎng)上可能流通著以次充好的郁金藥材,而且一般很難用肉眼來(lái)進(jìn)行產(chǎn)地鑒別。不同于西藥的單一組分,多數(shù)中藥藥效由多種藥效組分配伍而發(fā)揮其治療的作用,因此中藥的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證還存在一定困難和挑戰(zhàn)。

指紋圖譜技術(shù)被認(rèn)為是分析復(fù)雜中藥材的重要方法,在化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的幫助下,能從其指紋圖譜中挖掘復(fù)雜體系的有效信息,去冗求簡(jiǎn),并構(gòu)建準(zhǔn)確快速識(shí)別的數(shù)據(jù)庫(kù)[2 - 3]。高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)由于具有通用、穩(wěn)健和可重復(fù)性,常被用來(lái)鑒定復(fù)雜物質(zhì)(例如中藥和食品)的組成或有效成分、品質(zhì)和真?zhèn)?。特別是HPLC和GC具有非常強(qiáng)的分離能力,因此，由這兩種色譜方法構(gòu)建的樣品指紋圖譜可以清晰確認(rèn)某一種或幾種化合物成分在復(fù)雜物質(zhì)定性中的作用[4 - 5]。Qin等[6]應(yīng)用GC-MS法研究了黃絲郁金(C.Longa)、蓬莪術(shù)(C.Phaeocaulis)、溫郁金(C.Wenyujin)和廣西莪術(shù)(C.Kwangsiesis)的塊根和根莖,并發(fā)現(xiàn)了四種標(biāo)志物芳姜黃烯(ar-Curcumene)、芳姜黃酮(ar-Turmerone)、α-姜黃酮(α-Turmerone)和β- 姜黃酮(β-Turmerone)對(duì)塊根和根莖的鑒別起到了重要作用。Li等[7]應(yīng)用HPLC-MS法定性定量分析郁金藥材中的姜黃素類(lèi)化合物,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地和不同栽培年限藥材中姜黃素類(lèi)化合物的含量差別較大。Ni等[8]應(yīng)用GC-MS法和HPLC法研究復(fù)雜物質(zhì)(莪術(shù))并構(gòu)建其色譜指紋圖譜,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理后,兩類(lèi)數(shù)據(jù)得到比較好的融合,從而提高了對(duì)莪術(shù)樣品采用指紋圖譜進(jìn)行判別鑒定的準(zhǔn)確性。近紅外光譜(NIRS)測(cè)定具有快速、無(wú)損、需要樣品量少、能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn),目前已被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中復(fù)雜物質(zhì)的檢測(cè)和鑒定。NIRS測(cè)量的是有機(jī)分子中含氫基團(tuán)(-OH、-NH、-CH)振動(dòng)的合頻和各級(jí)倍頻峰吸收,因此其構(gòu)建的指紋圖譜能表達(dá)某類(lèi)或幾類(lèi)化合物的加和作用。NIRS的復(fù)雜性決定其依靠善于處理復(fù)雜信號(hào)、挖掘隱藏信息、可視化分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)解析[9 - 10]。

本文應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)和頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法(HS-GC-MS)分別測(cè)定郁金藥材水提物和揮發(fā)油的化合物組分;并應(yīng)用HPLC、GC和NIR分別構(gòu)建郁金藥材指紋圖譜,以期有的放矢高效用好中藥藥材。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 郁金樣品的采集

本研究共采集了三個(gè)產(chǎn)地的53份郁金樣品,其中四川2016批次8份(1#～8#),四川2017批次12份(9#～20#),廣西2016批次8份(21#～28#),廣西2017批次10份(29#～38#),浙江2017批次15份(39#～53#)。

1.2 樣品前處理

將郁金樣品打碎并過(guò)40目篩后,保存于自封塑料袋中,并盡快完成HS-GC-MS和NIRS檢測(cè)。樣品的HPLC-MS測(cè)定前處理如下:準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g郁金粉末樣品,加入20 mL二次蒸餾水，于50 ℃超聲30 min,之后將提取物過(guò)濾于25 mL容量瓶中。液相色譜進(jìn)樣前,將提取物過(guò)0.45 μm的濾膜。

1.3 檢測(cè)儀器及參數(shù)設(shè)置

NIRS測(cè)定:日立UV-4100紫外-可見(jiàn)-近紅外光譜儀,反射模式,掃程200～2 500 nm,掃描步長(zhǎng)2 nm,每個(gè)樣品掃描32次取其平均吸光度值。

HS-GC-MS測(cè)定:配備島津AOC 5000頂空自動(dòng)進(jìn)樣器的島津QP 2010 GC-MS儀,RTX-5毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。HS參數(shù)如下:溫度100 ℃,500 r/min轉(zhuǎn)動(dòng)25 min。GC參數(shù)如下:進(jìn)樣體積250 μL,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度230 ℃,柱溫程序,初始70 ℃(保持5 min)，以10 ℃/min升溫至140 ℃(保持2 min)。MS測(cè)定參數(shù)如下:接口溫度230 ℃,掃描范圍m/z30～500,掃描頻率0.30 scan/s。

HPLC-MS測(cè)定:Waters AQ 4000/2695 HPLC-MS儀,Zorbax Ecllipse Plus-C18柱(250×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱溫20 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm,進(jìn)樣體積20 μL。流動(dòng)相及梯度如下:流動(dòng)相為甲醇(A)和0.1%H3PO4(B),0～4 min，95%～90%B；4～30 min，90%～50%B；30～50 min，50%～8%B;MS條件如下:電噴霧離子化檢測(cè)器,解離溫度350 ℃,離子源溫度110 ℃,掃描范圍m/z50～1 000。

1.4 化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

由以上測(cè)試所得的郁金樣品數(shù)據(jù),包括NIRS、GC和HPLC,均在Matlab 7.0平臺(tái)上完成統(tǒng)計(jì)運(yùn)算。在本研究中,我們采用了KK-分析法(KK-Analysis)對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。KK-分析法是基于Matlab語(yǔ)言并包含多種無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法,如自組織地圖(SOM)和聚類(lèi)分析。其原理如下[11]:SOM首先由Teuvo Kohonen提出，因此也稱(chēng)做Kohonen地圖，它是一種將原始的多維數(shù)據(jù)壓縮成更低維數(shù)據(jù)的方法,這種壓縮技術(shù)叫做向量量化;SOM創(chuàng)造一個(gè)包含數(shù)據(jù)集模型的拓?fù)潢P(guān)系的信息網(wǎng)絡(luò)。

SOM是由很多節(jié)點(diǎn)組成的,每個(gè)節(jié)點(diǎn)被分配一個(gè)權(quán)重向量Wi;在某種意義上節(jié)點(diǎn)組成一個(gè)小的群落;Wi和原始的特征向量具有相同的維度。迭代步驟如下:

(1)

核心步驟就是鑒定距離真實(shí)輸入數(shù)據(jù)最近的節(jié)點(diǎn)，以及對(duì)于第j個(gè)模型來(lái)說(shuō)的最佳匹配單元(BMU)。一旦確定了BMU,它的權(quán)重就按照所謂的學(xué)習(xí)率逐漸調(diào)整。權(quán)重的調(diào)整過(guò)程如下:

Wi(t+1)=Wi(t)+φ(Δ,t)λ(t)(WI(t)-Vj(t))

(2)

式中φ是描述依賴(lài)節(jié)點(diǎn)升級(jí)的距離,而φ(Δ,t)是BMU的最大值。

聚類(lèi)分析可以分為無(wú)級(jí)區(qū)分和分級(jí)區(qū)分兩種技術(shù),本文應(yīng)用到的是無(wú)級(jí)區(qū)分策略,這種模式下需要預(yù)定義樣品分為幾個(gè)類(lèi),每次預(yù)定義的類(lèi)數(shù)目發(fā)生改變,整個(gè)聚類(lèi)過(guò)程將重新開(kāi)始。在模糊聚類(lèi)分析中,在一定程度上每一個(gè)模型都有可能屬于任何一個(gè)可能的類(lèi),因此一個(gè)模型到底屬于哪個(gè)類(lèi)是通過(guò)向量表達(dá)的。這個(gè)區(qū)分過(guò)程是通過(guò)一個(gè)矩陣M×K表示的,M是整個(gè)數(shù)據(jù)機(jī)的模型數(shù)目,K表示類(lèi)數(shù)目。區(qū)分的優(yōu)化過(guò)程是通過(guò)最小化目標(biāo)函數(shù)實(shí)現(xiàn)的。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HPLC-MS水提物組分分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)

將HPLC色譜數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)三個(gè)產(chǎn)地5個(gè)批次的郁金樣品共有21組共有峰(標(biāo)記為L(zhǎng)1～L21),見(jiàn)圖1(a)。經(jīng)過(guò)MS分子量以及組分最大紫外吸收的比對(duì),有12個(gè)組分被鑒定(表1),分別是:沒(méi)藥姜黃醇B(Bisacurone B)(L2),姜黃素(Curcumin)(L4),去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin)(L5),二去甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin)(L6),莪術(shù)醇(Curcumol)(L7),吉馬酮(Germacrone)(L11),芳姜黃酮(Arturmerone)(L12),莪術(shù)二酮(Curdione)(L13),莪術(shù)醇(Curcumenol)(L15),異莪術(shù)醇(Isocurcumenol)(L16),姜黃醇酮(Curcolone)(L18),姜黃醇(Curcumone)(L19)。

將21組共有峰數(shù)據(jù)作為變量輸入Matlab作為平臺(tái)的KK-分析法,進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2(a)。發(fā)現(xiàn)53個(gè)樣品大致分為三類(lèi),其中四川2016和2017兩批次樣品歸為一類(lèi),廣西2017和浙江2017批次樣品水提物差別不大,廣西2016批樣品獨(dú)自為一類(lèi);另外浙江2017批4個(gè)樣品(41#,44#,51#和53#)和廣西2016批次樣品較為相似。

表1 HPLC-MS法分析郁金樣品組分特性

2.2 HS-GC-MS揮發(fā)油組份分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)

將HS-GC測(cè)定數(shù)據(jù)導(dǎo)入指紋圖譜相似度軟件分析,發(fā)現(xiàn)三個(gè)產(chǎn)地5個(gè)批次的郁金樣品具有14組共有峰(標(biāo)記為G1～G14),見(jiàn)圖1(b)。經(jīng)過(guò)GC-MS化合物相似度軟件查詢(xún)并與文獻(xiàn)作比對(duì),這14個(gè)化合物分別確定為:3-蒈烯(3-carene)(G1)，α-蒎烯(α-Pinene)(G2)，莰烯(Camphene)(G3)，β-蒎烯(β-Pinene)(G4)，桉油精(Eucalyptol)(G5)，樟腦(Camphor)(G6)，龍腦(Borneol)(G7)，石竹烯(Caryophyllene)(G8)，α-檀香醇(α-Santalol)(G9)，α-石竹烯(α-Caryophyllene)(G10)，β-人參烯(β-Panasinsene)(G11)，臭樟腦(Napthalene)(G12)，廣藿香烯(Patchonlene)(G13)，異香樹(shù)烯(Isoaromadendren)(G14)。

將14個(gè)共有峰作為變量，利用前述KK-分析法做聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2(b)。發(fā)現(xiàn)三產(chǎn)地5批次的53份郁金樣品大致分為三類(lèi),其中四川2016和2017批次郁金樣品的揮發(fā)油組分含量較為相似,廣西2016和2017批次的樣品差別不大,浙江2017批次獨(dú)成聚為一類(lèi),另外浙江2017批次3個(gè)樣品(44#,51#和53#)不能和四川的樣品區(qū)分。

圖1 三個(gè)產(chǎn)地5個(gè)批次的53份郁金樣品HPLC(a)、HS-GC(b)和NIRS(c)檢測(cè)結(jié)果 Fig.1 The measured spectra of HPLC(a),HS-GC(b) and NIRS(c) for Radix Curcumae samples from three origins with five batches

2.3 NIRS全組分分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)

由于樣品的近紅外光譜測(cè)量易受溫度、散射和顆粒不均勻等因素的影響,故我們采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNVT)來(lái)校正測(cè)得的NIRS曲線(xiàn)(圖1(c))[12]。進(jìn)而將全光譜作為變量做統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2(c)。三產(chǎn)地5批次的郁金樣品可分為5類(lèi):四川2016批次,四川2017批次,廣西2016批次,廣西2017批次和浙江2017批次。同時(shí)我們可以看到浙江2017批次中,39#和廣西2016批次較相似,44#和四川2017批次較相似,53#和廣西2017批次分為一組?？梢?jiàn)不同產(chǎn)地不同批次間確實(shí)存在一定的差異。

為了驗(yàn)證無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別結(jié)果的準(zhǔn)確度，我們將每組樣品按2:1隨機(jī)分為校正集組(四川2016批次5個(gè),四川2017批次8個(gè),廣西2016批次5個(gè),廣西2017批次7個(gè),浙江2017批次10個(gè))和驗(yàn)證集組(四川2016批次3個(gè),四川2017批次4個(gè),廣西2016批次3個(gè),廣西2017批次-3個(gè),浙江2017批次5個(gè))。應(yīng)用經(jīng)典的有監(jiān)督模式識(shí)別方法最小二乘-支持向量機(jī)(LS-SVM)[13]處理校正組數(shù)據(jù)并建立驗(yàn)證模型,進(jìn)而用于對(duì)校正組和驗(yàn)證組分別進(jìn)行識(shí)別,可以發(fā)現(xiàn)校正組樣品識(shí)別率為100%,而驗(yàn)證組識(shí)別率為94.7%(參數(shù)gam=27.21,sig2=105.84)。

圖2 三個(gè)產(chǎn)地5個(gè)批次的53份郁金樣品HPLC(a)、HS-GC(b)和NIRS(c)檢測(cè)結(jié)果的聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.2 The clustering results of HPLC(a),HS-GC(b) and NIRS(c) for the Radix Curcumae samples from three origins with five batches

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用HPLC-MS和GC-MS分別分析中藥郁金的水提物和揮發(fā)油,26個(gè)化合物組分被準(zhǔn)確鑒定。HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)四川2016和2017批次水提物幾無(wú)差別,但廣西2016和2017批次差別較大。很明顯依據(jù)郁金藥材水提物的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西2017和浙江2017批次的郁金藥材質(zhì)量高于廣西2016批次。由GC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)四川2016和2017批次揮發(fā)油類(lèi)物質(zhì)之間差別不大,而廣西2016批次和廣西2017批次揮發(fā)油類(lèi)物質(zhì)含量較相似,浙江、廣西和四川3個(gè)產(chǎn)地郁金藥材的揮發(fā)油成分含量各不相同。本研究結(jié)果在醫(yī)院臨床實(shí)踐或者工廠(chǎng)配方制劑生產(chǎn)過(guò)程中可起到參考價(jià)值,以提高和控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究還應(yīng)用NIRs對(duì)中藥郁金的全組分測(cè)定,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法移除基線(xiàn)漂移和矯正散射影響后,構(gòu)建NIRs指紋圖譜,由NIRs解析的結(jié)果表明3個(gè)產(chǎn)地5個(gè)批次的郁金藥材存在組分間的差異,可以被鑒定并區(qū)分。