液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定兒童化妝品中3種異噻唑啉酮類防腐劑

楊永超， 閆 婧， 趙好力寶， 李 晶， 于智睿， 李學洋

(天津海關(原天津出入境檢驗檢疫局)工業(yè)產(chǎn)品安全技術中心，天津 300308)

異噻唑啉酮類化合物是一種廣譜、高效、非氧化性殺菌防腐劑，其中常見的有2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)和1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)，已廣泛用于工業(yè)循環(huán)冷卻水、紡織品柔光劑和上光劑及造紙工業(yè)等各個領域[1 - 3]。研究表明，該類物質(zhì)是一類致敏劑，可能引起過敏或皮炎等反應，過量接觸還可導致皮膚灼傷，其中CMI 和MI 的致敏性和刺激性最強[4 - 7]。兒童是弱勢群體，抵抗力較弱，更易受到侵害。目前，國內(nèi)外對食品接觸材料、玩具等日用品中異噻唑啉酮類殺菌劑的使用制定了嚴格的法規(guī)標準[8 - 11]。同時，異噻唑啉酮類化合物在歐盟化妝品法規(guī)中的限量要求也日益嚴苛[12 - 13]：至今，MI和CMI/MI(質(zhì)量比3∶1)混合物的限量均降至0.0015%，后者僅準用于淋洗類產(chǎn)品，且同一產(chǎn)品中兩者不可共用。我國現(xiàn)行的《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版) 規(guī)定MI的上限為0.01%，CMI/MI(3∶1)限量為0.0015%，且禁止用在留存型產(chǎn)品中，同時二者不可共用，這無疑為檢測技術提出了更高的要求。

《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)中異噻唑啉酮類化合物的檢測為高效液相色譜(HPLC)法，該方法靈敏度較低，MI和CMI定量限為13 mg/kg(即0.0013%)非常接近現(xiàn)有限量要求，且易出現(xiàn)假陽性，已無法滿足檢測需求。此外，異噻唑啉酮類化合物的檢測方法還有紫外分光光度法[14 - 15]、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[16 - 17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[18 - 19]等。LC-MS/MS法分析時間短、選擇性好，靈敏度高，更加適合復雜體系中異噻唑啉酮類化合物的測定。然而，LC-MS/MS方法檢測化妝品中異噻唑啉酮類物質(zhì)的文獻報道很少，并且只檢測MI和CMI兩種防腐劑，未涉及BIT。對于兒童化妝品中異噻唑啉酮類防腐劑的檢測更是未見報道。在此基礎上，本文建立了一種簡單、快速、準確的同時測定兒童化妝品中3種異噻唑啉酮類防腐劑含量的LC-MS/MS方法，該方法能夠滿足現(xiàn)有化妝品指令對這類防腐劑的限量要求，同時可有效保護兒童消費者安全。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

LC-MS/MS系統(tǒng)(美國，Thermo Fisher公司)；S 30H型超聲波清洗機(德國，Elma公司) 。

2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)(CAS：2682-20-4，純度：98.2%)， 5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)(CAS：26172-55-4，純度：99.0%)，1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)(CAS：2634-33-5，純度：99.9%)，均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。分別稱取10 mg(精確至0.1 mg)MI、CMI和BIT標準品于50 mL容量瓶中，以0.4%乙酸溶液定容，配成3種質(zhì)量濃度為200 mg/L的標準溶液；每種標準溶液移取1.0 mL(精確至0.1 mL)至10 mL容量瓶，純水定容，得濃度為20 mg/L混合儲備液。甲醇(色譜純，美國Grace)；甲酸(色譜純，美國Aladdin)；乙酸(色譜純，天津賽孚瑞)；實驗用水為超純水。

1.2 樣品制備

稱取1.0 g(精確至0.0001 g)樣品，置于15 mL帶蓋帶刻度樣品管中，加入10 mL超純水，混勻，超聲提取20 min，取上層清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待測。

1.3 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：Waters Symmetry?C18色譜柱(150×2.1 mm，3.5 μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液(45∶55,V/V)，等度洗脫，流速200 μL/min；柱溫：室溫；進樣體積：5.0 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細管電壓：4 000 V；鞘氣壓力：241 kPa；輔助氣壓力：69 kPa；毛細管溫度：350 ℃；監(jiān)測模式：選擇反應監(jiān)測(SRM)模式；采集時間：8 min。質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示。

表1 MI、CMI和BIT的MS/MS采集參數(shù)

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

MI、CMI和BIT 均是含氮雜環(huán)化合物，易結合H+形成正離子，因此分析過程選擇電噴霧電離正離子模式(ESI+)。首先，對待測物進行一級質(zhì)譜分析，優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子源溫度等參數(shù)，獲得待測化合物穩(wěn)定的準分子離子峰。之后，對待測物的分子離子進行二級質(zhì)譜碎片分析，選取強度較大的3個子離子，并優(yōu)化碰撞能量、豐度最高的特征子離子作為定量離子，其它兩個作為定性離子(表1)。

2.2 色譜柱的選擇

本方法對Waters XTERRA?MS C18色譜柱(100×2.1 mm,3.5 μm)和Waters Symmetry?C18色譜柱(150×2.1 mm,3.5 μm)進行了考察。同一標準溶液，在相同流動相的條件下，二者的峰形都比較好，兩根柱子的第一個峰的響應值幾乎無差別，但是Waters Symmetry?C18柱第二個峰和第三個峰的響應值明顯更高。因此，選擇Waters Symmetry?C18色譜柱。

2.3 流動相的選擇

3種防腐劑均是含氮雜環(huán)化合物，易結合H+，因此流動相的水相采用含0.1%的甲酸。考察乙腈-0.1%甲酸溶液(體積比為30∶70)和甲醇-0.1%甲酸溶液(體積比為40∶60)兩種流動相，分別進行等度洗脫。結果表明：(1)采用前者時，CMI的峰后延且CMI和BIT峰分離度不高；(2)采用后者時，峰形和分離度較好。因此，采用甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相。為進一步縮短測試時間，方法加大了甲醇的比例，最終選擇甲醇-0.1%甲酸溶液(45∶55,V/V)作為流動相，等度洗脫，洗脫可在5 min內(nèi)完成。

2.4 提取溶劑的選擇

MI、CMI和BIT都是極性化合物，易溶于水、甲醇。本方法考察了水和甲醇對3種防腐劑的提取情況(圖1)。從圖中可看到，甲醇的提取效率略高，但是考慮到：一方面水無毒；另一方面兒童接觸化妝品主要是嘴和皮膚兩種途徑，水更接近兒童的唾液和汗液，并且文獻和相關標準[19-20]采用的提取溶劑為水。因此，方法選用水作為提取溶劑。

2.5 提取時間優(yōu)化

方法以水為提取溶劑，分別測試了3、5、10、15、20 min時的提取效率，見圖2。爽膚水和面霜樣品中MI和CMI相對比較容易提取，基本10 min之內(nèi)提取完全，而眼影中BIT則至少需要15 min完全提取。為確保樣品中防腐劑全部提取，本方法提取時間最終定為20 min。

2.6 線性范圍

精密吸取混合標準儲備液，以去離子水稀釋，得到3種防腐劑質(zhì)量濃度均為5、10、20、50、100、200、500 、1 000、2 000 μg/L的系列混合標準溶液(共計9個濃度點，若樣品濃度超出范圍，可按比例適當稀釋)。按1.3儀器條件上機測試，記錄3種異噻唑啉酮化合物的峰面積，每個濃度點測試3次，取平均值。以濃度(x,μg/L) 為橫坐標，主峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸。得到的回歸曲線如表2所示。結果顯示，3種防腐劑在5～2 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好。

表2 MI、CMI和BIT的線性回歸方程及相關系數(shù)

2.7 檢測限、定量限和檢出濃度、最低定量濃度

采用逐級稀釋標準溶液方法進樣，以信噪比(S/N)為3的樣品濃度為檢測限濃度；以S/N為10的樣品濃度為定量限濃度。本方法對3種防腐劑MI、CMI和BIT的檢測限和定量限分別為2.0、2.0、1.0 μg/L和5.0、5.0、2.0 μg/L；當取樣量為1.0 g，定容體積為10 mL時對應的最低檢出濃度、最低定量濃度分別為0.020、0.020、0.010 μg/g和0.050、0.050、0.020 μg/g。

2.8 回收率和精密度(RSD)試驗

取空白面霜類化妝品，分別添加0.075、0.150、0.750 μg混合標準品，每個濃度點平行6份，然后按照1.2節(jié)方法制備樣品，1.3節(jié)儀器條件上機測試。記錄峰面積，根據(jù)線性方程分別計算樣品中MI、CMI和BIT的含量，得出相應回收率，結果見表3。實驗結果表明，3種防腐劑的添加回收率在94.0%～105.6%之間，相應測定結果的RSD均小于5%(n=6)。該方法準確度和精密度良好。

表3 3種異噻唑啉酮化合物的添加回收實驗結果(n=6)

2.9 樣品檢測

取市售11種兒童化妝品，按前述方法制備樣品，上機測試，測試化妝品中3種防腐劑的含量。結果如表4所示，11種樣品中3種樣品檢出防腐劑，包括保濕霜(Nourishing cream)、眼影(Eye shadow)和潤膚霜(Moisturizing lotion)。3個陽性樣品中，只有眼影(Eye shadow)未超限量要求，其他兩種則明顯超標，證明兒童化妝品市場存在風險。

表4 11種實際樣品檢測結果

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3 討論

針對目前國內(nèi)外化妝品最新法律法規(guī)的限量要求，結合我國兒童化妝品乃至整個化妝品行業(yè)特點，本文建立了測定兒童化妝品中3種異噻唑啉酮類防腐劑的LC-MS/MS方法。該方法線性范圍廣，精密度良好，靈敏度高，可滿足最新的化妝品指令要求。將該方法應用于11種市售兒童化妝品中3種防腐劑的檢驗，檢出3個陽性樣品，其中2個嚴重超出限量值，表明風險是存在的，兒童化妝品市場監(jiān)管有待加強。