短期飼喂兩種類型纖維對生長豬后腸菌群結構和主要代謝產物的影響

張 玲，李 華，趙 瑤，陳代文，余 冰，何 軍，虞 潔，羅鈞秋，毛湘冰，鄭 萍，黃志清，羅玉衡

（四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所/教育部動物抗病營養(yǎng)重點實驗室，成都611130）

單胃動物后腸寄居著數(shù)量龐大的微生物群落，被認為是動物體內的另一個“器官”[1]，可直接或間接參與宿主機體的營養(yǎng)代謝和免疫調節(jié)[2-3]，是影響動物健康和生長性能的重要因素之一。日糧纖維（dietary fiber，DF）是一種不能被動物體分泌的消化液所降解的復雜碳水化合物，依據(jù)其水溶性可分為可溶性日糧纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性日糧纖維（insoluble dietary fiber，IDF）。大量研究表明，DF對腸道微生物群落結構及其功能具有明顯影響[4-5]，因此，研究不同類型/種類的DF與豬后腸微生物群落的相互關系，對生產上科學利用不同類型纖維源，優(yōu)化飼糧配方，降低飼料成本，及促進無抗飼糧研發(fā)具有重要意義。飼糧中添加不同類型和/或水平的可發(fā)酵碳水化合物均可影響豬腸道微生物多樣性和組成。在公豬飼糧中添加獼猴桃纖維可改變其結腸細菌群落結構，增加結腸總細菌和擬桿菌屬（Bacteroides）細菌數(shù)量，腸桿菌屬（Enterobacteria）和大腸埃希菌（Escherichia coli）數(shù)量減少[6]。顧憲紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1%菊粉可提高仔豬盲腸內乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的數(shù)量。短鏈脂肪酸（SCFAs）是腸道微生物發(fā)酵碳水化合物的主要代謝產物，纖維來源及種類的不同，導致發(fā)酵模式的改變，進而影響代謝產物濃度。成年母豬采食含高水平抗性淀粉（34%）飼糧后，腸道中柔嫩梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）的相對豐度增加，Escherichia coli和假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）的相對豐度降低，且盲腸和結腸中SCFAs濃度明顯增加[8]。有限的研究集中于一種或幾種DF對豬腸道特定菌群的影響，而不同類型（尤其是可溶與不可溶性DF）與生長豬后腸微生物群落的相互關系并不清楚。因此，本研究結合變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術、實時熒光定量（Real-time PCR）和氣相色譜技術，比較短期飼喂典型SDF（燕麥β-葡聚糖）和IDF（微晶纖維素microcrystalline cellulose，MCC）后，生長豬后腸微生物群落結構的差異、幾種特定細菌和產甲烷菌的數(shù)量變化，及主要代謝產物濃度的差異，以期為科學配制含纖維飼糧提供參考。

1 材料和方法

飼養(yǎng)試驗于2015年7—8月在四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所教學科研基地進行；PCR-DGGE、Real-time PCR和氣相色譜分析于2015年9—11月在四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所教育部動物抗病營養(yǎng)重點實驗室進行。

1.1 試驗設計及試驗動物

采用單因子試驗設計，選擇16頭體況一致、健康的（40.38±1.19）kg杜洛克×長白×大約克育肥閹公豬。預試期1 w，所有豬只飼喂基礎日糧（日糧中不含非飼糧源性DF），自由采食和飲水以適應環(huán)境。預試期結束后，單個空腹稱重，按體重無差異原則隨機分為SDF組和IDF組2個處理組，每個處理組8頭豬，正式試驗為期21 d。

1.2 纖維來源

試驗使用的燕麥β-葡聚糖購自陜西慈緣生物科技有限公司，淡黃色粉末狀，純度為70%；MCC購自曲阜市天利藥用輔料有限公司，白色粉末狀，純度≥99%。

1.3 試驗動物日糧及飼養(yǎng)管理

參照NRC 2012和中國豬飼養(yǎng)標準配制各組日糧。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗開始前，所有試豬飼喂基礎日糧。試驗期間每天08：00，13：00和18：00定時飼喂，每次飼喂以料槽內剩有少量飼料為宜，記錄給料量及余料量，日常觀察并記錄健康狀況。

1.4 直腸內容物采集

在試驗第1，3，6，12，21天直腸刺激法無菌采集所有試豬新鮮糞樣，于-20℃保存，用于腸道微生物群落結構分析；第1天和第21天另采集一份保存于-80℃，用于SCFAs濃度檢測。

1.5 指標測定

1.5.1 直腸細菌基因組DNA的提取及PCR擴增

采用試劑盒（QIAamp DNA Stool Mini Kit，德國）提取直腸內容物宏基因組DNA作為擴增模板。以通用引物968f-GC和1401r引物擴增細菌16S rDNA V6-V8可變區(qū)[9]。PCR反應程序為：94℃5 min，94℃30 s，56℃20 s，68℃40 s，35個循環(huán)，68℃延伸7 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。

1.5.2 DGGE及條帶分析

DGGE采用Bio-Rad Dcode電泳系統(tǒng)進行，變性劑濃度梯度為45%～60%。使用1×TAE緩沖液，80 V、60℃電泳12 h，硝酸銀染色，凝膠顯色定影后用CS800校正型光密度掃描分析系統(tǒng)留圖。采用Quantity one 4.6.2軟件分析DGGE圖譜，計算條帶數(shù)，進行聚類分析并計算多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）。

表1 日糧組成和營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient level of experimental diets（air dry basis） %

1.5.3 SCFAs測定

使用VARIAN CP-3800氣相色譜儀（美國）測定直腸內容物中的乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs含量。由于上述3種酸是豬后腸主要SCFAs，故本試驗中以3種酸含量之和表示總SCFAs含量。

1.5.4 Real-time PCR擴增

H.C.庫爾納柯夫于1900年提出，在室溫以上溫度下，液態(tài)烴產品與其他非極性組分混合物的黏度與組分黏度之間的關系呈非線性變化，其混合油黏度可以通過組分油黏度的不同函數(shù)的線性加和來表達，如式(1)。

采用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀對直腸內容物中的特定菌群進行定量，主要檢測菌群及引物序列見表2。反應體系（10μL）含：SYBR Premix ExTaqⅡ5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH2O 3μL。反應程序參照文獻進行設定。以梯度稀釋后的各純化PCR產物為模板建立標準曲線并計算拷貝數(shù)。

表2 用于定量檢測的特定菌群的引物序列Table 2 The specific primers for certain microbial groups using in the real-time PCR analysis

表3 不同DF對生長豬生產性能的影響Table 3 Effect of two types of DF on the performance of growing pigs

1.6 數(shù)據(jù)分析

不同時間點直腸內容物細菌Shannon指數(shù)的差異采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，并進行Duncan氏多重比較，其余數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，0.05＜P＜0.1表示差異具有顯著趨勢。結果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 兩種日糧纖維對生長豬生產性能的影響

由表3可知，SDF組和IDF組試豬末重，ADG和ADFI差異均不顯著（P＞0.05）；與IDF組相比，SDF組豬只料重比有降低趨勢（0.05＜P＜0.1）。

2.2 兩種DF對生長豬后腸細菌群落結構和多樣性的影響

DGGE圖譜的UPGAMA聚類分析結果顯示，SDF組第1天和第21天樣品被明顯區(qū)分為兩簇：第1天6個樣品聚于一簇，相似性為0.53，第21天6個樣品聚于一簇，相似性為0.51（圖1，A）；IDF組第1天和第21天樣品被明顯分為兩簇：第1天8個樣品聚于一簇，相似性為0.51，第21天7個樣品聚于一簇，相似性為0.55（圖1，B）。

通過比較同一處理不同時間點Shannon指數(shù)（表4），發(fā)現(xiàn)兩個處理組樣品均在不同時間點表現(xiàn)出明顯差異，SDF組為第3、6、12天樣品的Shannon指數(shù)顯著低于第1和21天（P＜0.01），第21天樣品的Shannon指數(shù)顯著低于第1天；IDF組則是第1天樣品的Shannon指數(shù)顯著低于其余各采樣時間點。

圖1 PCR-DGGE圖譜聚類分析Figure 1 Cluster analysis of PCR-DGGE profile

表4 不同時間點兩處理豬直腸細菌群落多樣性指數(shù)Table 4 The bacterial Shannon index in the rectal samples of pigs in the two different groups collected at different

2.3 兩種DF對生長豬直腸特定菌群數(shù)量的影響

由表5可知，試驗末期，SDF組豬只直腸內容物中總細菌數(shù)量極顯著降低（P＜0.01）；Firmicutes和Lactobacillus數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；Escherichia coli數(shù)量極顯著增加（P＜0.01）；SRB和Bifidobacterium數(shù)量略微上升（0.05＜P＜0.1）；產甲烷菌數(shù)量有降低趨勢（0.05＜P＜0.1）。Firmicutes、Prevotella和Escherichia coli是IDF組變化最大的細菌，試驗結束時，F(xiàn)irmicutes數(shù)量極顯著降低（P＜0.01），Prevotella和Escherichia coli數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。

2.4 兩種DF對生長豬直腸內容物SCFAs含量的影響

由表6可知，試驗末期SDF組試豬直腸內容物中乙酸含量較試驗初顯著降低（P＜0.05），丙酸和總SCFAs含量呈下降趨勢（0.05＜P＜0.1）；乙酸、丙酸、丁酸比例在試驗初、末差異不顯著（P＞0.05）。試驗末期IDF組試豬直腸內容物中乙酸、丙酸、丁酸含量及乙丙比較試驗初期顯著降低（P＜0.05），總SCFAs含量較試驗初期極顯著降低（P＜0.01），其中乙酸相對濃度顯著高于試驗初期（P＜0.05），丙酸和丁酸比例較試驗初期略有上升（0.05＜P＜0.1）。

表5 不同采樣時間點兩處理豬直腸特定菌群數(shù)量[log10（拷貝數(shù)）/g干重]Table 5 The quantity of certain bacterial groups in the rectal samples of pigs in the two different groups collected at different time points[log10（copy numbers of gene）/gram of dry weight]

表6 試驗初、末兩處理組豬直腸內容物中SCFAs含量Table 6 The concentrate of SCFAs in the rectal samples of pigs in the two different groups at the beginning and end of the experiment

3 討論

兩種DF對試豬直腸微生物群落結構的影響截然不同。飼喂含SDF飼糧后，試豬直腸微生物多樣性降低，而飼喂含IDF飼糧后，試豬直腸微生物多樣性則升高，且DGGE圖譜的聚類分析結果表明采食含兩種DF的飼糧后，兩組豬后腸菌群均發(fā)生了明顯變化（試驗開始和結束時直腸菌群分別聚于兩簇），暗示豬后腸細菌群落對SDF和IDF兩種DF的響應可能完全不同。

就考察的特定微生物的組成而言，兩種不同DF對生長豬后腸菌群數(shù)量的影響也表現(xiàn)出明顯差異。Firmicutes是動物機體主要細菌門類之一，盡管其數(shù)量在兩個處理組均呈現(xiàn)為降低，但IDF組降低幅度更大（SDF組降幅為4.6%，IDF組為23%），可能與該門細菌更偏好植物性多糖和低聚糖有關[23]，而MCC屬于人工合成純纖維素，F(xiàn)irmicutes對底物的選擇性使其對MCC的利用程度較低。Prevotella是一類被證明可以利用纖維素和木聚糖的菌屬[24]，在人類的相關研究中發(fā)現(xiàn)，攝入植物性多糖時，該菌是腸道中的優(yōu)勢菌屬[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)飼喂含外源DF的飼糧后，兩處理組豬直腸內容物中該菌屬數(shù)量均增加，但IDF組增加幅度更大，說明該菌不僅可利用天然纖維素，可能對可溶性植物纖維和合成純纖維素也有一定降解能力，暗示其生長底物的廣泛性。我們對常見的Bifidobacterium和Lactobacillus兩種益生菌以及常見致病菌（Escherichia coli）也進行了考察。前人研究表明單獨添加瓜爾膠（一種典型SDF）可促進Lactobacillus的生長，而添加纖維素刺激Bifidobacterium生長[27]，但本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加SDF后，生長豬后腸兩種益生菌的數(shù)量均表現(xiàn)為降低，且采食含兩種DF的飼糧后，豬直腸Escherichia coli數(shù)量均增加。造成這種變化的原因可能如下：①本研究中添加的SDF是燕麥β-葡聚糖，黏度較高，食糜在腸腔中停留時間較長有利于腸桿菌的生長[28]；②MCC具有吸水膨脹的特性，提高腸道排空速率，其獨特的“清掃”機制[29]可從腸腔帶走大量微生物；③直腸是單胃動物的末端腸道，腸腔pH環(huán)境偏中性不利于喜酸性的益生菌生長[30]，但兩種DF的添加是否影響腸腔pH未知。該結果同時暗示并非所有的DF都對動物腸道健康有利，配制含纖維飼糧時應綜合考慮DF的類型、來源和添加量。

SRB和產甲烷菌是單胃動物后腸的兩大類耗氫微生物[31]，可通過移除發(fā)酵體系的氫來提高后腸微生物的發(fā)酵效率。飼喂含β-葡聚糖飼糧后，試豬后腸SRB數(shù)量增加，而產甲烷菌數(shù)量略微降低，說明在發(fā)酵β-葡聚糖的過程中，兩種菌之間可能存在競爭關系。而飼喂含MCC飼糧后并未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，暗示SRB和產甲烷菌對飼糧中IDF的響應可能并不敏感。

SCFAs是微生物主要代謝產物，在微生物與宿主營養(yǎng)及免疫關系中扮演重要角色[32-33]。本研究中短期飼喂含兩種DF的飼糧后，生長豬后腸SCFAs濃度均降低，但相對IDF組而言，SDF組乙酸、丙酸、丁酸和總SCFAs含量均較高。前人研究也發(fā)現(xiàn)飼糧中添加3%菊粉降低仔豬后腸中總SCFAs含量[34]，尤其是乙酸含量，但具體原因有待探明。IDF組各SCFAs含量降低的同時，乙酸、丙酸和丁酸的相對比例也發(fā)生改變，表現(xiàn)為乙酸比例升高，丙酸和丁酸比例降低。說明豬后腸微生物對SDF和IDF具有明顯不同的發(fā)酵模式。我們前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內存在利用燕麥β-葡聚糖和MCC的核心菌群[35-36]，很可能由于核心菌群對底物的選擇性利用造成了兩種DF后腸發(fā)酵模式的不同。

4 結論

①短期（21 d）攝入含SDF（以燕麥β-葡聚糖為代表）和IDF（以MCC為代表）飼糧后，生長豬生長性能不受影響，但含SDF飼糧可降低采食量和料重比。

②飼糧中短期添加SDF（純度≥70%）降低生長豬后腸細菌多樣性，添加IDF（純度≥99%）則傾向于提高生長豬后腸細菌多樣性。

③與試驗開始時相比，采食含SDF飼糧21 d后，生長豬后腸總細菌、Firmicutes和Lactobacillus數(shù)量降低；采食含IDF飼糧后，豬后腸中Prevotella數(shù)量升高。本試驗條件下，攝入含SDF或IDF飼糧均不利于后腸益生菌Bifidobacterium和Lactobacillus的生長，但兩種DF造成豬后腸Escherichia coli數(shù)量增加的機制可能不同。

④與試驗開始時相比，采食含SDF飼糧21 d后，生長豬后腸SCFAs（尤其是乙酸）濃度降低；而采食含IDF飼糧后，豬后腸乙酸、丙酸、丁酸和總SCFAs濃度均降低，說明豬后腸微生物對IDF和SDF的發(fā)酵模式明顯不同。

⑤不同類型或來源的DF可能通過與后腸微生物的互作，影響豬腸道內環(huán)境和腸道健康，最終可能影響宿主對營養(yǎng)物質的利用效率。生產上配制飼糧配方時，應將DF對腸道微生物的影響納入考慮范圍。