甜櫻桃GalDH、GalLDH的克隆及在果實(shí)發(fā)育過(guò)程的表達(dá)

黃曉婧，趙雪雯，呂秀蘭，梁 東*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，成都611130）

抗壞血酸（ascorbicacid，AsA）又稱維生素C（vitamin C），是一種水溶性抗氧化有機(jī)小分子[1]，在植物中不僅是重要的抗氧化劑和輔酶因子[2]，而且還影響植物碳氮代謝[3]、非生物逆境抗性[4]、細(xì)胞生長(zhǎng)[5-6]，參與激素合成[7]與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[8]。AsA與人類健康密切相關(guān)[9]，但是人體自身不能合成，必須從食物中獲取，因此研究植物中AsA的形成及調(diào)控機(jī)制，改良植物組織中的AsA的含量對(duì)植物的自身生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆生長(zhǎng)以及對(duì)人類健康都具有重要的意義。

高等植物合成AsA有4條途徑，目前公認(rèn)的大多數(shù)植物體內(nèi)AsA合成的主要途徑是L-半乳糖途徑[10-11]。L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（L-galactono-1，4-lactone dehydrogenase，GalLDH）與L-半乳糖脫氫酶（L-galactose dehydrogenase，GalDH）是該途徑中的最后2個(gè)脫氫酶。GalDH催化L-半乳糖脫氫生成L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯，再經(jīng)GalLDH進(jìn)一步脫氫合成AsA。AsA合成機(jī)制的研究過(guò)去主要集中于擬南芥、煙草等模式植物，對(duì)多年生木本植物果實(shí)中形成機(jī)制的研究很少，尤其是具有“早春第一果”之稱的甜櫻桃。甜櫻桃（Prunus aviumL.）屬薔薇科李亞科李屬櫻亞屬（Subgenus cerasus），是人類獲取Vc的重要果品資源。本研究以甜櫻桃“佐藤錦“為材料，克隆AsA生物合成關(guān)鍵酶基因GalDH和GalLDH，并分析其在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步深入研究甜櫻桃抗壞血酸合成分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜櫻桃“佐藤錦”果實(shí)采于四川省雅安市漢源縣九襄鎮(zhèn)甜櫻桃示范園，樹(shù)齡5～7年生，管理?xiàng)l件一致。全樹(shù)70%以上花瓣脫落視為第0天，于花后第0、10、20、30、40、50天進(jìn)行定株均勻采樣，以單株作為實(shí)驗(yàn)單元，3次重復(fù)。每次取樣后，迅速在冰上切成小塊，在液氮中速凍，最后存放在-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 總RNA的提取

甜櫻桃總RNA的提取采用改良CTAB-LiCI法[12]。取1μL總RNA在1%瓊脂凝膠上電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其在280、260、230 nm處吸光度以確定濃度、純度后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因的克隆

以總RNA作為模板，按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。根據(jù)在NCBI上查找到的同源性較高的甜櫻桃或桃的GalDH和GalLDH基因，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物(見(jiàn)表1)，以甜櫻桃cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板2μL、10μm的正義引物與反義引 物各1μL、buffer 2.5μL、MgCl22μL、dNTP 2μL、Taq酶0.5μL、ddH2O 14μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃45 s，退火56℃或54℃1 min，72℃90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保持。其產(chǎn)物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，用膠純化回收試劑盒回收目的片段，連接克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，經(jīng)氨芐青霉素（Amp）抗性篩選后，挑取白色單菌落，搖菌后進(jìn)行菌液PCR鑒定，并選取陽(yáng)性克隆送至成都擎科生物公司測(cè)序。

1.4 序列分析

根據(jù)測(cè)序得到的PacGalDH和PacGalLDH基因的cDNA全長(zhǎng)序列，利用DNAstar EditSeq查找開(kāi)放閱讀框；利用DNAMAN軟件推導(dǎo)相應(yīng)的氨基酸序列以及分析與其他植物GalDH和GalLDH基因編碼的氨基酸序列的同源性；序列比對(duì)用Bioedit 5，Protparam軟件分析蛋白理化性質(zhì)；隨后用MEGA5和ClustalX 2軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 基因表達(dá)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定GalDH和GalLDH在甜櫻桃果實(shí)各個(gè)長(zhǎng)期的表達(dá)水平。據(jù)cDNA測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)定量表達(dá)引物PacGalDH、PacGalLDH、內(nèi)參基因Actin和EF（見(jiàn)表1）。然后按照SYBR Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：SYBR Green qPCR SuperMix 10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，cDNA模板1.5μL，ddH2O 6.9μL。反應(yīng)程序：95℃10 min，95℃10 s，60℃，31 s，72℃20 s，溶解曲線反應(yīng)，共40個(gè)循環(huán)，每樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后觀察熒光值變化曲線和熔解曲線，利用2-ΔΔCt法[13]分析結(jié)果。

表1 基因克隆及表達(dá)引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression in this study

1.6 甜櫻桃果實(shí)中T-AsA含量的測(cè)定

稱取果實(shí)樣品約0.5 g，用5 mL 0.2%偏磷酸水溶液研磨充分（冰上研磨且避光），倒入10 mL離心管，4℃條件下8 000 r/min離心10 min，用0.22μm的濾頭過(guò)濾后可上機(jī)檢測(cè)；液相條件：流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10μL，波長(zhǎng)243 nm，柱溫箱溫度25℃；流動(dòng)相為甲醇∶水=15∶85。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010計(jì)算試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，采用SPSS20.0進(jìn)行顯著性分析，使用SigmaPlot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PacGalDH和PacGalLDH基因的克隆與序列分析

以甜櫻桃佐藤錦果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，以表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收純化目的片段并與pMD19-T載體相連，經(jīng)PCR鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示：PacGalDH基因的cDNA全長(zhǎng)為1 253 bp，含有975 bp完整的開(kāi)放閱讀框，編碼324個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖1A），GenBank登錄號(hào)為KX196291。利用Protparam軟件分析，其編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為34.89 kD，理論等電點(diǎn)值為5.79，帶正電荷殘基總數(shù)35，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)為38，總平均親水性（GRAVY）為-0.009。PacGalLDH基因的cDNA全長(zhǎng)為1 914 bp，含有1 791 bp完整的開(kāi)放閱讀框，編碼596個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖1 B），GenBank登錄號(hào)為KX196292。其編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為67.47 kD，理論等電點(diǎn)值為8.47，帶正電荷殘基總數(shù)82，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)為77，總平均親水性（GRAVY）為-0.445。

2.2 PacGalDH和PacGalLDH基因序列的同源性分析

在NCBI上搜索PacGalDH與PacGalLDH基因編碼氨基酸的同源序列，發(fā)現(xiàn)PacGalDH和PacGalLDH基因編碼的氨基酸序列與其他植物的抗壞血酸合成相關(guān)基因編碼的氨基酸具有極高的同源性，其中與梅（Prunus mume）、桃（Prunus persica）、蘋(píng)果（Malus x domestica）、梨（Pyrus x bretschneideri）、棗（Ziziphus jujuba）、葡萄（Vitis vinifera）等植物的GalDH和GalLDH編碼的氨基酸序列同源性均在95%以上。其中PacGalDH基因與桃（BAH03302.1）的相似性達(dá)到98%，PacGalLDH基因與梅（XP_008236174.1）的相似性達(dá)到98%。

為了確定PacGalDH與PacGalLDH與其他植物的同緣關(guān)系，利用MEGA 5.10軟件與ClustalX2軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖2）。通過(guò)圖2A可以看出，PacGalDH與桃（BAH03302.1）和梅（XP_008236174.1）的分支較近，同源性高達(dá)96%，其次是蘋(píng)果（AAP21783.1）和梨（XP_009346449.1），與柑橘（XP_006486798.1）的分支最遠(yuǎn)；PacGalLDH與桃（BAH03303.1）的分支最近，同源性高達(dá)100%，其次是梅（XP_008240731.1）、蘋(píng)果（NP_001315785.1）和梨（XP_009349063.1），與軟棗獼猴桃（AKA45052.1）的分支最遠(yuǎn)。

2.3 佐藤錦果實(shí)發(fā)育過(guò)程中T-AsA含量變化及PacGalDH和PacGalLDH的表達(dá)模式分析

利用HPLC測(cè)定佐藤錦果實(shí)發(fā)育過(guò)程中TAsA含量變化，如圖3A，在花后0 d，果實(shí)中T-AsA含量最高，達(dá)44.7 ng/g。在花后0～10 d急劇下降，在第40 d達(dá)到最低值，隨后在果實(shí)完全成熟之前TAsA含量雖有上升但不顯著。

圖1 甜櫻桃GalDH(A)和GalLDH基因(B)的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PacGalDH(A)and PacGalLDH(B)

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了PacGalDH、PacGalLDH在佐藤錦果實(shí)發(fā)育過(guò)程的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：花后10 d，PacGalDH的表達(dá)量顯著上升，達(dá)到峰值；隨后其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。PacGalLDH的表達(dá)量在0～10 d緩慢上升，之后10～50 d呈下降趨勢(shì)，在花后50 d的表達(dá)量低于花后0 d的表達(dá)量。從整體來(lái)看，PacGalDH在果實(shí)中的表達(dá)量要高于PacGalLDH（見(jiàn)圖3B）。

3 討論與結(jié)論

生物合成是植物細(xì)胞AsA積累的主要原因[11，14]。大量研究證實(shí)L-半乳糖途徑是高等植物AsA生物合成的主要途徑，如蘋(píng)果[15]、獼猴桃[16]、西印度櫻桃[17]、桃[18]、黑加侖[19]，有的植物如擬南芥[20]甚至將L-半乳糖途徑作為唯一的AsA合成途徑，對(duì)AsA生物合成代謝調(diào)控的研究多集中在這一途徑[21]。有研究認(rèn)為GalDH是L-半乳糖生物合成途徑的重要依據(jù)，并且還是植物自身能否合成AsA的前提[22]。目前，關(guān)于甜櫻桃GalDH和GalLDH的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)佐藤錦甜櫻桃果實(shí)AsA L-半乳糖合成途徑相關(guān)基因GalDH和GalLDH的克隆與表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)基因在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育周期均有表達(dá)，并且表達(dá)量變化趨勢(shì)與果實(shí)T-AsA積累水平有較高的相似性，這表明甜櫻桃果實(shí)AsA生物合成存在L-半乳糖途徑，并且該途徑很可能是甜櫻桃AsA合成累積的主要途徑。

圖2 GalDH(A)和GalLDH基因(B)推導(dǎo)的氨基酸與其他植物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of GalDH(A)and GalLDH(B)gene

圖3 甜櫻桃果實(shí)T-AsA含量(A)及GalDH和GalLDH基因的表達(dá)量變化(B)Figure 3 Changes of T-AsA concentration as well as GalDH and GalLDH expression levels in the sweet cherry fruit

關(guān)于AsA生物合成的一些關(guān)鍵酶活性和一些基因的表達(dá)共同調(diào)節(jié)果實(shí)中AsA含量變化已有一些研究[23-26]。在Jiang Z.Y.等[27]的研究中，GalDH的活性與其對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)與獼猴桃果實(shí)采后AsA含量顯著正相關(guān)，雖然GalLDH也有較高活性，但是其表達(dá)在采后期間基本沒(méi)變化。這一結(jié)果與鐘雨[28]的研究結(jié)果一致。高靜等[29]對(duì)“皇家嘎啦”蘋(píng)果的研究表明GalDH是幼果期蘋(píng)果果實(shí)L-半乳糖途徑中的關(guān)鍵限速酶。在本研究中，PacGalDH與PacGalLDH的表達(dá)量變化趨勢(shì)在整體上與T-AsA水平變化基本一致，但是PacGalDH在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間的表達(dá)量要顯著高于PacGalLDH，進(jìn)一步說(shuō)明GalDH基因與甜櫻桃AsA的積累顯著相關(guān)，GalDH可能控制甜櫻桃AsA生物合成。