食源色氨酸添加量對(duì)不同密度下刺參生長(zhǎng)和代謝酶活性的影響

張恩棟, 董雙林, 王 芳, 田相利, 高勤峰

(1 中國(guó)海洋大學(xué)，教育部海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266003；2 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116081)

高養(yǎng)殖密度通過(guò)擁擠脅迫影響魚(yú)類的生長(zhǎng)和健康[1-3]。動(dòng)物在脅迫情況下，代謝維持能的供給配比增加，新陳代謝從合成代謝向分解代謝轉(zhuǎn)變，以提供更多的能量抵御和應(yīng)對(duì)脅迫[4]。色氨酸(Trp)是人類食物和動(dòng)物飼料中的重要組成成分[5-6]，是合成5-羥色胺(5-HT)的前體[7]，能降低動(dòng)物血漿中皮質(zhì)醇、去甲腎上腺素和腎上腺素的含量。在魚(yú)類等脊椎動(dòng)物[8-12]包括人類[13]的食物中，添加Trp能夠降低神經(jīng)內(nèi)分泌對(duì)脅迫的響應(yīng)，與免疫應(yīng)答[14]以及動(dòng)物健康[15]存在相關(guān)性。刺參(ApostichopusjaponicusSelenka)是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖動(dòng)物，也是俄羅斯、日本、朝鮮和韓國(guó)等國(guó)重要的漁業(yè)資源[16-17]。本項(xiàng)目組前期研究了高養(yǎng)殖密度對(duì)刺參生長(zhǎng)的抑制[18]，而Trp對(duì)刺參的脅迫緩解能力未見(jiàn)報(bào)道。本研究定量測(cè)定刺參對(duì)密度脅迫的二級(jí)響應(yīng)指標(biāo)，分析食源性Trp對(duì)密度脅迫下刺參生長(zhǎng)和代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料的組成為馬尾藻粉(70%)、海泥(20%)和魚(yú)粉(10%)，其中，灰分占59.9%、粗蛋白占16.56%、粗脂肪占8.52%，能值6.67 kJ/g。試驗(yàn)用L-色氨酸購(gòu)自Sigma(USA)，飼料中添加量為0%、1%、3%和5%。飼料原料過(guò)100目篩，用水和成面團(tuán)后制成直徑1.0 mm顆粒，45 ℃烘干，-20 ℃儲(chǔ)藏、備用。試驗(yàn)用刺參購(gòu)自青島市即墨區(qū)田橫羊山海參專業(yè)合作社。試驗(yàn)開(kāi)始前，刺參用無(wú)添加色氨酸的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，馴化2周。

1.2 方法

經(jīng)馴化后挑選960頭體質(zhì)量(濕重)為(3.5 ± 0.1)g的健康刺參，隨機(jī)分配和養(yǎng)殖于64個(gè)40 L (53 cm×28 cm×34 cm) 的玻璃水族箱中。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)養(yǎng)殖密度組，即每箱4、8、16和32頭，分別標(biāo)記為L(zhǎng)、ML、MH和H。每個(gè)養(yǎng)殖密度組分別投喂含色氨酸0%、1%、3%和5%的飼料。共設(shè)16個(gè)處理組，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。按照Dong等[19]的試驗(yàn)方法，刺參經(jīng)過(guò)24 h饑餓后測(cè)定初始體質(zhì)量。飼養(yǎng)試驗(yàn)75 d結(jié)束時(shí)，每個(gè)密度組的所有動(dòng)物分別稱重，測(cè)定各指標(biāo)。養(yǎng)殖期間，每個(gè)水族箱用氣石持續(xù)充氣，每天更換3/4體積的海水，溶氧高于5.0 mg /L，水溫控制在(17 ± 0.5)℃，pH (8.0 ± 0.2)，鹽度30，氨氮低于0.25 mg/L。

樣品采集與處理：試驗(yàn)開(kāi)始前，隨機(jī)選取30頭馴養(yǎng)后的刺參稱重，65 ℃烘干至恒重，計(jì)算刺參含水量。試驗(yàn)期間，每天上午10：00過(guò)量投喂刺參飼料，22 h后，采用虹吸法分別收集殘飼和糞便。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)刺參禁食24 h。所有刺參均被稱重，計(jì)算生物量和增重率。

Wt-gain=100% × (W2-W1)/W1

(1)

式中：Wt-gain為增重率；W1和W2是刺參的初始和終末濕重，g。

代謝酶活力測(cè)定：用剪刀取刺參體壁貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩ｓw壁谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)活力分別采用賴氏法、分光光度法、Ochoa[20]和Wrobleuiski 等[21]方法，用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

色氨酸含量和養(yǎng)殖密度對(duì)刺參生長(zhǎng)、呼吸代謝酶活性的影響采用雙因素方差(two-way ANOVA)分析。數(shù)據(jù)用SPSS17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Duncan多重比較分析不同處理組間的差異顯著性，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 色氨酸對(duì)密度脅迫下刺參生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，刺參生物量隨著養(yǎng)殖密度增加而增加，但體質(zhì)量增重率卻隨養(yǎng)殖密度的增加而下降。較低密度組(L和ML組)的體質(zhì)量增長(zhǎng)率顯著高于較高密度組(MH和H組)(P<0.05)。

圖1 不同養(yǎng)殖密度及色氨酸水平下刺參的生物量和增重率Fig.1 Biomass and weight gain of Apostichopus japonicus Selenka with different stocking densities and Trp levels

2.2 色氨酸對(duì)刺參代謝酶活力的影響

2.2.1 ALT和AST酶活力

本試驗(yàn)中，較高養(yǎng)殖密度的MH和H組刺參的ALT酶活力與較低養(yǎng)殖密度的L和ML組差異顯著(P<0.05)(圖2)。各養(yǎng)殖密度下，添加色氨酸組刺參的酶活力均高于未加色氨酸的對(duì)照組，MH對(duì)照組酶活性顯著高于其他密度的對(duì)照組(P<0.05)。較高密度組，隨著色氨酸添加量的增加，ALT活力呈下降趨勢(shì)。色氨酸對(duì)較低密度組刺參的ALT活力無(wú)顯著影響。AST呈現(xiàn)與ALT相似的趨勢(shì)。

2.2.2 LDH和MDH酶活力

隨著養(yǎng)殖密度增大，刺參乳酸脫氫酶(LDH)活力升高，但到了H組卻下降(圖3)。較低密度組與較高密度組的LDH酶活力差異顯著(P<0.05)。與AST和ALT相似，MH組的LDH和蘋果酸脫氫酶(MDH)的活力高于對(duì)照組，而在MH和H組，添加色氨酸的處理組酶活力下降(圖3)。在MH和H組，投喂3%色氨酸處理組的LDH活力低于其他處理組。MDH活力趨勢(shì)與LDH相似。在各養(yǎng)殖密度下，添加3%色氨酸的處理組，酶活力低于其他處理組。

圖2 不同養(yǎng)殖密度及色氨酸水平下刺參的ALT、AST酶活力Fig.2 ALT activity and AST activity of Apostichopus japonicus Selenka with different stocking densities and Trp levels

圖3 不同養(yǎng)殖密度和投喂不同色氨酸水平刺參MDH和LDH酶活力Fig.3 MDH activity and LDH activity of Apostichopus japonicus Selenka with different stocking densities and fed with different levels of Trp

3 討論

3.1 高密度養(yǎng)殖抑制刺參個(gè)體生長(zhǎng)

研究人員對(duì)卡特拉魚(yú)(Catlacatla)[22]、銀鯰(Rhamdiaquelen)[23]和鱸(Dicentrarchuslabrax)[24]的研究發(fā)現(xiàn)，高養(yǎng)殖密度使動(dòng)物個(gè)體生長(zhǎng)率下降。本研究中，對(duì)照組低養(yǎng)殖密度組刺參的增重率高于高養(yǎng)殖密度組。這表明高養(yǎng)殖密度的脅迫效應(yīng)抑制了刺參生長(zhǎng)(圖1、圖2)。

3.2 食源色氨酸提高刺參生長(zhǎng)性能

色氨酸為必需氨基酸，是生物合成5-HT的限速性底物。5-羥色胺(5-HT)是大腦中主要的神經(jīng)遞質(zhì)[25-26]，能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物復(fù)雜的行為、心理和生理過(guò)程[7]。色氨酸羥化酶是利用色氨酸合成5-HT所需要的酶，因此，色氨酸含量的增加可提高5-HT的合成效率[27]。另一方面，迅速消耗色氨酸已廣泛作為一種安全有效地降低大腦5-HT的生理學(xué)方法[28]。給動(dòng)物喂養(yǎng)色氨酸可降低動(dòng)物的進(jìn)攻行為和高密度引起的脅迫。本研究中，與對(duì)照組相比，添加食源色氨酸能夠顯著促進(jìn)刺參個(gè)體生長(zhǎng)(P<0.05)(圖1)。添加食源色氨酸后，低養(yǎng)殖密度組刺參的增重率高于高養(yǎng)殖密度組；而飼料中添加3%色氨酸后，刺參呈現(xiàn)出最大增重率。Walton等[29]和Tejpal等[30]對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和鯪(Cirrhinusmrigala)的研究顯示，喂色氨酸的幼魚(yú)能夠提高魚(yú)類生長(zhǎng)性能和存活率。而本研究中，飼料添加5%色氨酸，刺參生長(zhǎng)性能下降，這可能是由于色氨酸過(guò)量造成的。過(guò)量氨基酸對(duì)生物產(chǎn)生毒性，對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響[31-33]。

3.3 食源色氨酸影響刺參代謝酶活性

代謝反映生物能量消耗的生理過(guò)程。在糖異生作用中，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是蛋白質(zhì)代謝中轉(zhuǎn)氨作用的主要酶[30]。Chatterjee等[34]報(bào)道，魚(yú)類受脅迫期間，轉(zhuǎn)氨酶活性的升高會(huì)引起攝入酮酸增加，進(jìn)而通過(guò)氧化代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)。本研究中，AST和ALT活力都隨著色氨酸含量從1%添加至3%而下降，而相應(yīng)的對(duì)照組AST和ALT活力則較高(圖2)。轉(zhuǎn)氨酶活力降低可認(rèn)為是添加色氨酸對(duì)刺參脅迫的緩解。對(duì)照組中的蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)活力也比色氨酸添加組要高(圖3)。MDH活力增高表明，動(dòng)物通過(guò)提高三羧酸循環(huán)代謝水平來(lái)滿足能量需求的增加，以應(yīng)對(duì)脅迫。

4 結(jié)論

較高刺參放養(yǎng)密度(16和32頭/40 L)與低密度(4、8頭/40 L)相比，對(duì)刺參明顯造成脅迫，雖然生物量增加，但生長(zhǎng)率下降。飼料中添加1%～3%食源色氨酸能夠緩解脅迫，降低代謝酶AST、ALT、MDH、LDH活力，提高刺參生長(zhǎng)率。

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