蝦青素對(duì)肝脂代謝與晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)作用

左正宇，邵 洋，劉 楊，卜怡然，王華林，李 娜，劉志國(guó)*

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見(jiàn)的慢性肝病，病程上可從單純性的脂肪性變性發(fā)展到非酒精性脂肪性肝炎，甚至肝硬化、肝癌[1]。NAFLD與肥胖、高脂血癥、II型糖尿病密切相關(guān)，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟中的表征[2-3]，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)健康問(wèn)題[4]。目前普遍被接受的NAFLD的發(fā)病機(jī)制是“二次打擊”學(xué)說(shuō)[5]，其中細(xì)胞內(nèi)以氧化應(yīng)激為主的各種應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致疾病發(fā)展的重要因素[6]。

蝦青素（astaxanthin，AX）是存在于微藻、真菌和甲殼類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的一種脂溶性類(lèi)胡蘿卜素[7-8]，它是一種天然的抗氧化劑，能夠猝滅活性氧并清除自由基[9]，具有抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病及心血管和神經(jīng)保護(hù)等多種有益作用[10-11]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)蝦青素可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的肝功能障礙以及血脂升高，并能抑制炎癥因子的釋放，有效防止肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥和脂肪沉積[7,12]，從而對(duì)改善NAFLD有積極作用。但蝦青素改善肝脂代謝的具體機(jī)制尚不十分清楚。特別是近年的研究發(fā)現(xiàn)高脂負(fù)荷可導(dǎo)致脂質(zhì)吸收與代謝異常，同時(shí)也伴隨晝夜節(jié)律的紊亂，兩者的關(guān)系廣受關(guān)注[13]。

生物節(jié)律也稱(chēng)生物鐘，是生物（尤其是哺乳動(dòng)物）體內(nèi)影響動(dòng)物行為及各種生理生化活動(dòng)，隨日落日出而呈現(xiàn)晝夜變化的自主性分子機(jī)制，它會(huì)隨外界環(huán)境（如光/暗、溫度等）變化而對(duì)節(jié)律作相應(yīng)調(diào)整和修正[14]。對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，生物鐘包括中樞時(shí)鐘系統(tǒng)與外周時(shí)鐘系統(tǒng)。中樞節(jié)律位于下丘腦的視交叉神經(jīng)核，受外界環(huán)境改變和內(nèi)源性物質(zhì)的影響。外周節(jié)律存在于外周組織的肝、腸、心臟等器官中，調(diào)控外周組織的代謝活動(dòng)，它一方面受中樞節(jié)律的控制，另一方面又受進(jìn)食及營(yíng)養(yǎng)因素的影響[15-16]。尤其對(duì)于肝臟來(lái)說(shuō)，其既是全身營(yíng)養(yǎng)代謝的中心，又是外周時(shí)鐘系統(tǒng)中的核心器官，通過(guò)晝夜節(jié)律調(diào)控體內(nèi)能量代謝限速酶的表達(dá)以調(diào)節(jié)代謝的方向和速度[17]。高脂所致的代謝異常同時(shí)伴隨晝夜節(jié)律的紊亂，蝦青素通過(guò)改善氧化應(yīng)激，緩解NAFLD的進(jìn)展，這一作用是否與改善節(jié)律調(diào)節(jié)相關(guān)，或是否對(duì)代謝基因表達(dá)存在節(jié)律性的調(diào)節(jié)作用目前尚屬未知。

本研究通過(guò)高脂/高膽固醇飼喂建立NAFLD小鼠模型及添加蝦青素的干預(yù)模型，研究蝦青素對(duì)NAFLD代謝異常的改善作用以及對(duì)高脂所致的生物節(jié)律絮亂的干預(yù)作用。對(duì)研究蝦青素干預(yù)對(duì)晝夜節(jié)律的影響以及針對(duì)性地開(kāi)展蝦青素營(yíng)養(yǎng)干預(yù)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠60 只（許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018） 湖北省疾病預(yù)防控制中心湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心；蝦青素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%） 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所；動(dòng)物飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司。

TRIzol（生化試劑）、逆轉(zhuǎn)錄酶、寡核苷酸（18 nt Oligo（dT）） 寶生生物工程有限公司；dNTPs、異丙醇（分析純）、SYBR Green熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）Mix 北京艾德萊生物科技有限公司；氯仿（分析純）天津市天力化學(xué)試劑有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測(cè)定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）測(cè)定試劑盒南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

專(zhuān)業(yè)型梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；超微量紫外分光光計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientif i c公司；酶標(biāo)儀瑞士TECAN公司；qPCR儀 美國(guó)ABI公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；正置光學(xué)顯微鏡、凝膠成像系統(tǒng) 日本NIKON公司；可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料配方

參考前期實(shí)驗(yàn)建立動(dòng)物模型[18]，選用SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠60 只，7～8 周齡，體質(zhì)量（20f1）g，飼料參照Hayek西方飲食模型飼料配比，分為對(duì)照組（CON組）、高脂模型組（HFD組）、高脂添加蝦青素組（AX組）。飼料配方見(jiàn)表1，能量構(gòu)成見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼料配方Table1 Nutrient composition of diets g

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼料能量構(gòu)成Table2 Feed energy constituents

1.3.2 動(dòng)物分組及造模

60 只小鼠均飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置為：溫度（23f2）℃，相對(duì)濕度55%～65%，12 h光照/12 h黑暗環(huán)境，即7：00開(kāi)燈、19：00關(guān)燈。光暗環(huán)境中的時(shí)間用授時(shí)時(shí)間表示，ZT0為光照開(kāi)始時(shí)間，ZT12為光照結(jié)束時(shí)間。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠按體質(zhì)量排序隨機(jī)分成3 組（每組20 只），分別為CON組、HFD組、AX組。自由飲食，喂養(yǎng)11 周后測(cè)其糖耐量，12 周后每組各10 只分別在ZT0、ZT12兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，小鼠處死前禁食12 h，自由飲水。以5 mg/mL戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈采血，將血液置于放有肝素鈉的EP管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液保存于－80 ℃冰箱中待用。分離肝臟，一部分保存于－80 ℃冰箱，一部分固定于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中待用。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)及脂肪指數(shù)的測(cè)定

在小鼠處死前，稱(chēng)量每只小鼠的體質(zhì)量并記錄。處死小鼠后，取出小鼠肝臟、腎周脂肪及附睪脂肪墊，用生理鹽水去除表面血污，濾紙吸干，稱(chēng)質(zhì)量記錄。小鼠肝臟指數(shù)與肥胖指數(shù)分別按照式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定

在飼喂12 周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，按照各血液生化指標(biāo)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法分別檢測(cè)血清TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度和ALT、AST活力。

1.3.5 病理學(xué)檢測(cè)

取相同位置肝臟，放入盛有體積分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛溶液的標(biāo)本瓶中固定。24 h后將固定的肝組織脫水，石蠟包埋并切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，先后用伊紅、蘇木精染色和復(fù)染，梯度脫水后用二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，用顯微鏡觀(guān)察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.3.6 qPCR檢測(cè)肝組織基因表達(dá)

采用TRIzol法提取肝臟總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。20 μL體系如下：總RNA 1 μg，5hgDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，5hPrimeScript Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，4hRT Primer Mix 1.0 μL，加RNase free dH2O至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。所得cDNA保存于－80 ℃待用。

采用SYBR Green qPCR方法定量檢測(cè)相關(guān)代謝基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）基因、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase cluster determinant 36，CD36）基因、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）基因、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxy-lase，CYP7A1）基因以及節(jié)律時(shí)鐘基因時(shí)鐘晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)器（clock circadian regulator，CLOCK）基因、腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)體樣蛋白1（brain and muscle ARNT-like 1，BMAL1）基因引物序列如表3所示，內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin。20 μL體系如下：SYBR Green Mix 10 μL，RT-Product 2 μL，正向引物（300 nmol/L）0.6 μL，反向引物（300 nmol/L）0.6 μL，ddH2O 6.8 μL。最后根據(jù)qPCR儀給出的Ct值采用相對(duì)定量法計(jì)算實(shí)驗(yàn)中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表3 qPCR引物Table3 qPCR primers

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果以fs表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析方法采用ANOVA的Tukey’s test方法，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素干預(yù)對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)以及肥胖指數(shù)的影響

如圖1所示，與CON組相比，HFD組的體質(zhì)量高度顯著增加（P＜0.001）。AX組小鼠體質(zhì)量與HFD組相比無(wú)明顯差異。HFD組小鼠肝臟指數(shù)相較CON組高度顯著增加（P＜0.001），而AX組與HFD組相比高度顯著降低（P＜0.001）。HFD組肥胖指數(shù)比CON組高度顯著增加（P＜0.001），添加蝦青素干預(yù)后，肥胖指數(shù)極顯著降低（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，高脂飼喂導(dǎo)致了小鼠肥胖及肝臟肥大，使其脂肪沉積增加，而蝦青素干預(yù)則可顯著改善肝臟指數(shù)與肥胖指數(shù)。

圖1 蝦青素對(duì)小鼠體質(zhì)量（A）、肝臟指數(shù)（B）與肥胖指數(shù)（C）的影響Fig.1 Effect of astaxanthin on body mass (A), liver index (B) and obesity index (C) in mice

2.2 蝦青素干預(yù)對(duì)小鼠血脂水平及晝夜節(jié)律的影響

從圖2可以看出，高脂/高膽固醇飼喂12 周后，小鼠血清主要血脂水平呈現(xiàn)總體升高趨勢(shì)（HDL-C濃度下降），尤其以TC和LDL-C濃度升高顯著，而經(jīng)過(guò)蝦青素干預(yù)后，高脂所致血脂異常得到顯著改善。進(jìn)一步觀(guān)察血脂的晝夜節(jié)律變化情況，結(jié)果顯示不同血脂指標(biāo)在ZT0（早）、ZT12（晚）間呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律且差異明顯。

圖2 小鼠血脂水平及晝夜節(jié)律變化Fig.2 Changes in blood lipid levels and circadian rhythm in mice

小鼠是夜間活動(dòng)的動(dòng)物，與人的晝夜節(jié)律相反。本實(shí)驗(yàn)中，ZT0是光照開(kāi)始的時(shí)間，對(duì)應(yīng)于小鼠夜間活動(dòng)結(jié)束；ZT12是光照結(jié)束的時(shí)間，對(duì)應(yīng)于小鼠休息結(jié)束的時(shí)間。圖2顯示，各組TG濃度在ZT0時(shí)均極顯著高于ZT12時(shí)（P＜0.01，P＜0.001），呈現(xiàn)顯著的早晚差異。ZT12時(shí)HFD組TG濃度高于CON組，但差異不顯著，而AX組TG濃度均顯著低于HFD組（P＜0.05）。TC濃度的晝夜節(jié)律變化與TG濃度有所不同，各組在ZT0時(shí)TC濃度均略低于ZT12時(shí)，但無(wú)顯著性差異。其中HFD組不管在ZT0時(shí)還是ZT12時(shí)均高度顯著高于CON組，而AX組經(jīng)蝦青素干預(yù)后TC濃度明顯恢復(fù)，并在ZT12時(shí)顯著低于HFD組。LDL-C濃度的變化更為顯著，CON組在ZT12時(shí)LDL-C濃度顯著高于ZT0時(shí)（P＜0.05），表明正常飼養(yǎng)時(shí)小鼠LDL-C濃度呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律變化；在高脂飼養(yǎng)條件下，LDL-C濃度大幅升高，早晚間的差異消失，蝦青素干預(yù)則顯著降低了LDL-C濃度，但尚未恢復(fù)到正常水平和晝夜節(jié)律。HDL-C濃度的變化與LDL-C濃度相反，CON組在ZT0時(shí)高于ZT12時(shí)，HFD組在ZT0時(shí)高度顯著降低，且晝夜節(jié)律消失，而蝦青素干預(yù)可大幅提高HDL-C濃度。

總地來(lái)說(shuō)，高脂飼喂導(dǎo)致小鼠肝臟血脂水平升高（HDL-C濃度除外），尤其是TC濃度升高明顯，而蝦青素干預(yù)可以有效降低TC和LDL-C濃度，升高HDL-C濃度，改善脂質(zhì)的代謝。血脂的晝夜節(jié)律波動(dòng)是正常的生理現(xiàn)象，反映了機(jī)體晝夜代謝活動(dòng)的差異，高脂飼養(yǎng)條件下，脂代謝的負(fù)荷增加，打破了正常的脂質(zhì)波動(dòng)規(guī)律，呈現(xiàn)異常的血脂晝夜節(jié)律變化。推測(cè)蝦青素干預(yù)能改善脂質(zhì)代謝，部分恢復(fù)血脂水平和正常節(jié)律。

2.3 蝦青素干預(yù)對(duì)高脂誘導(dǎo)的肝損傷的緩解作用

當(dāng)肝細(xì)胞受到實(shí)質(zhì)性損傷時(shí)，胞漿中的ALT與AST會(huì)被釋放出來(lái)，導(dǎo)致其在血清中的活力上升。因此，血清中ALT、AST活力是衡量肝損傷的最佳特征標(biāo)記。圖3結(jié)果顯示，與CON組相比，HFD組小鼠血清中ALT和AST活力均高度顯著升高。AX組ALT、AST活力較HFD組極顯著降低，但沒(méi)有回落到CON組水平。表明HFD組小鼠存在顯著的肝受損情況，添加蝦青素干預(yù)則可顯著緩解肝臟的損傷。

圖3 小鼠血清AST（A）、ALT（B）活力Fig.3 Serum AST (A) and ALT (B) activity in mice

2.4 肝臟組織病理學(xué)變化分析

圖4 小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果Fig.4 HE staining of liver tissue in mice

如圖4所示，HFD組小鼠肝葉細(xì)胞腫脹，大小不一的脂滴散布于胞質(zhì)中，細(xì)胞核居邊，細(xì)胞與細(xì)胞之間的界限模糊不清，肝竇狹窄，肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。AX組脂肪變性與炎性浸潤(rùn)程度較HFD組都有相應(yīng)減輕。

2.5 蝦青素對(duì)肝臟脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況的影響

圖5 肝臟脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況Fig.5 mRNA expression of hepatic lipid metabolism-related genes

如圖5所示，F(xiàn)ASN是內(nèi)源性脂肪酸合成的限速酶，在控制脂肪酸合成中具有重要作用。CON組中FASN mRNA的表達(dá)存在顯著的晝夜節(jié)律變化，即ZT0時(shí)（反映動(dòng)物的活動(dòng)狀態(tài)）的mRNA表達(dá)量高度顯著高于ZT12時(shí)（反映動(dòng)物的休息狀態(tài)）（P＜0.001）；而在高脂飼養(yǎng)條件下，F(xiàn)ASN mRNA表達(dá)的節(jié)律變化發(fā)生顯著改變，在ZT0時(shí)mRNA表達(dá)量極顯著低于CON組（P＜0.01），而在ZT12時(shí)反而高度顯著高于CON組，反映了高脂飼養(yǎng)導(dǎo)致FASN mRNA表達(dá)及內(nèi)源性脂肪酸合成節(jié)律的絮亂。經(jīng)蝦青素干預(yù)后，F(xiàn)ASN mRNA的表達(dá)量恢復(fù)到正常節(jié)律特征（ZT0時(shí)高、ZT12時(shí)低），并均低于CON組的表達(dá)水平，表明添加蝦青素干預(yù)后，F(xiàn)ASN mRNA表達(dá)及其代表的內(nèi)源性脂肪酸合成在ZT0和ZT12時(shí)同步受到抑制。

CD36是肝細(xì)胞上攝取脂肪酸的受體，其mRNA表達(dá)也呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化，其在ZT0時(shí)的表達(dá)量高于ZT12時(shí)。而HDF組CD36 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，早晚間的表達(dá)量差異縮小。蝦青素干預(yù)則可同步增加CD36 mRNA在早晚的表達(dá)量。

上述結(jié)果表明，蝦青素對(duì)改善高脂條件下內(nèi)源性脂肪酸的合成和血液中脂肪酸的攝取有顯著作用，同時(shí)其對(duì)高脂所致相關(guān)基因表達(dá)的節(jié)律紊亂有較好的保護(hù)作用。

2.6 蝦青素干預(yù)對(duì)肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)與節(jié)律變化的影響

如圖6所示，HMGCR是膽固醇合成的關(guān)鍵酶，HMGCR節(jié)律表達(dá)特征與FASN和CD36完全不同，它主要以ZT12時(shí)（小鼠的休息時(shí)間）的表達(dá)為主。正常小鼠HMGCR mRNA水平在ZT12時(shí)高度顯著高于ZT0時(shí)。HFD組HMGCR mRNA早晚的表達(dá)都高度顯著降低，但以ZT12時(shí)為主，此時(shí)，膽固醇的合成受到顯著抑制，早晚間的波動(dòng)差距（幅度）減小。AX組有所恢復(fù)，但作用并不明顯。

圖6 肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)與節(jié)律變化Fig.6 mRNA expression and circadian rhythm of hepatic cholesterol metabolism-related genes

CYP7A1是膽固醇氧化合成膽汁酸的關(guān)鍵酶，其表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)肝臟膽固醇從膽汁中排出。CON組在ZT12時(shí)的CYP7A1 mRNA表達(dá)量極顯著低于光照開(kāi)始（ZT0）時(shí)，而HFD組則主要在ZT12時(shí)表達(dá)量升高，從而表現(xiàn)出與CON組相反的晝夜節(jié)律波動(dòng)，AX組可以糾正這種波動(dòng)異常，主要上調(diào)ZT0時(shí)的表達(dá)，與CON組相似。

2.7 蝦青素對(duì)肝臟時(shí)鐘基因mRNA表達(dá)量及晝夜節(jié)律的影響

生物鐘核心轉(zhuǎn)錄因子CLOCK/BMAL1通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件增強(qiáng)盒（enhancer-box，E-box）調(diào)控時(shí)鐘基因的表達(dá)及晝夜節(jié)律變化。核心回路中，BMAL1和CLOCK在細(xì)胞核內(nèi)形成異二聚體與PER和CRY基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box結(jié)合，從而激活PER與CRY基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)PER與CRY在細(xì)胞質(zhì)中的積累達(dá)到閾值，PER和CRY蛋白形成二聚體PER/CRY，進(jìn)入細(xì)胞核競(jìng)爭(zhēng)性抑制CLOCK/BMAL1二聚體與E-box結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄，通過(guò)這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)參與生理過(guò)程與生物鐘的調(diào)控。

如圖7所示，CON組CLOCK mRNA的表達(dá)存在顯著的晝夜節(jié)律變化，ZT0時(shí)高度顯著高于ZT12時(shí)（P＜0.001）。高脂飼養(yǎng)條件下晝夜節(jié)律消失，在ZT0時(shí)HDF組高度顯著低于CON組（P＜0.001）；而在ZT12時(shí)HFD組略低于CON組，但無(wú)顯著性差異。CLOCK/BMAL1是生物體內(nèi)相對(duì)保守的、以轉(zhuǎn)錄-翻譯為基礎(chǔ)的自身轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)回路。有研究表明，BMAL1基因的絕對(duì)表達(dá)量低于CLOCK基因，所以BMAL1基因的mRNA表達(dá)調(diào)控著CLOCK/BMAL1異二聚體含量[19]。BMAL1基因的表達(dá)存在著顯著的晝夜節(jié)律，光照開(kāi)始時(shí)（ZT0），HFD組極顯著低于CON組，經(jīng)蝦青素干預(yù)后BMAL1 mRNA表達(dá)量得到高度顯著恢復(fù)（P＜0.001）；在光照結(jié)束時(shí)（ZT12）BMAL1 mRNA表達(dá)量高度顯著低于光照開(kāi)始（ZT0），且各組間mRNA表達(dá)量趨于一致，且無(wú)顯著差異。高脂飼養(yǎng)條件下，BMAL1 mRNA表達(dá)量晝夜節(jié)律振幅降低，蝦青素干預(yù)能改善高脂所致的節(jié)律異常。

圖7 生物鐘核心轉(zhuǎn)錄因子CLOCK（A）、BMAL1（B）mRNA表達(dá)與節(jié)律變化Fig.7 mRNA expression and rhythmic changes of biological clock core transcription factor CLOCK (A) and BMAL1 (B)

3 討 論

目前關(guān)于NAFLD發(fā)病機(jī)制的研究已取得非常大的進(jìn)展，“二次打擊”（肝脂肪變性所形成的“初次打擊”及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激等導(dǎo)致的“二次打擊”）學(xué)說(shuō)已被普遍認(rèn)同[5]。高脂/高膽固醇飲食會(huì)引起顯著的脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激，并可能誘發(fā)NAFLD等多種慢性代謝疾病[20-21]。蝦青素是天然的抗氧化劑[22]，能改善高脂飲食所致的肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)和脂質(zhì)過(guò)氧化[23-24]，從而打破高脂小鼠的肝臟氧化應(yīng)激和末端激酶激活的惡性循環(huán)[25]。本研究結(jié)果顯示，飼喂12 周后HFD組小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)和肥胖指數(shù)均顯著增加，蝦青素干預(yù)能顯著抑制高脂/高膽固醇飲食誘導(dǎo)的肝臟指數(shù)、肥胖指數(shù)的增加。蝦青素還能降低小鼠肝臟TC和LDL-C濃度，提高HDL-C濃度，降低ALT、AST活力，從而降低血脂水平，緩解肝臟的損傷。在代謝途徑上，檢測(cè)結(jié)果顯示蝦青素能降低脂肪酸合成限速酶FASN的表達(dá)，抑制脂肪酸的合成，此外，蝦青素也能降低膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGCR在肝臟中的表達(dá)，減少內(nèi)源性膽固醇的合成，同時(shí)提高CYP7A1的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇氧化生成膽酸，促進(jìn)膽固醇的分泌與排出[26]。有研究顯示，蝦青素可誘導(dǎo)肝組織ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1/G1的表達(dá)，從而增強(qiáng)了載脂蛋白A-1/HDL介導(dǎo)的肝X受體（liver X receptor，LXR）非依賴(lài)性巨噬細(xì)胞膽固醇流出[27]。這與本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到AX組小鼠HDL-C濃度顯著高于CON組與HFD組相印證。

哺乳動(dòng)物的代謝活動(dòng)具有明顯的節(jié)律特點(diǎn)，肝臟作為外周時(shí)鐘系統(tǒng)的主要器官控制組織的代謝節(jié)律[25,28]。核心節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子CLOCK和BMAL1及其靶基因PER和CRY構(gòu)成自反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，PER和CRY基因表達(dá)產(chǎn)物又反饋抑制CLOCK-BMAL1復(fù)合物，抑制其自身的表達(dá)[29]。核心回路與代謝相關(guān)核受體相連接，通過(guò)核受體亞家族1 D組成員1（nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，REV-ERBα）[19]、維甲酸相關(guān)孤核受體α（retinoid-related orphan receptor α，RORα）[30]及過(guò)氧化物酶增殖體激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα）[31-32]調(diào)節(jié)代謝。REV-ERBα和RORα既可以反饋調(diào)節(jié)核心節(jié)律分子的表達(dá)，也可以影響胰島素誘導(dǎo)因子2（insulin-induced gene 2，INSIG2）的表達(dá)，促進(jìn)了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBPs）的激活[30,33]。SREBPs決定著膽固醇和脂肪酸合成中具有關(guān)鍵功能的酶的節(jié)奏表達(dá)[34]。有研究顯示，SREBP2調(diào)控HMGCR的循環(huán)轉(zhuǎn)錄，膽固醇節(jié)奏性的產(chǎn)生可以引起LXR核受體的循環(huán)激活，其作為CYP7A1轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵激活劑催化膽汁酸合成中的限速步驟，受核因子法尼酯X激活受體/小異二聚體伴侶途徑的調(diào)控，后者也同時(shí)受REV-ERBα的調(diào)節(jié)[35]。因此，節(jié)律循環(huán)通過(guò)核受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)脂肪酸與膽固醇的合成與代謝，從而改善脂質(zhì)代謝。本研究中，高脂/高膽固醇飼喂導(dǎo)致小鼠脂代謝負(fù)荷增加的同時(shí)，也破壞了正常的脂質(zhì)波動(dòng)規(guī)律，蝦青素干預(yù)能夠緩解或修正由高脂導(dǎo)致的生物鐘節(jié)律相關(guān)基因CLOCK和BMAL1以及肝臟早晚脂質(zhì)和膽固醇代謝相關(guān)基因晝夜節(jié)律表達(dá)的紊亂。文獻(xiàn)[36]報(bào)道，蝦青素是PPARα的激動(dòng)劑，PPARα可以通過(guò)與BMAL1和REV-ERBα的啟動(dòng)子區(qū)域PPAR反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)BMAL1與REV-ERBα的轉(zhuǎn)錄[37]，此外，PPARα通過(guò)促進(jìn)INSIG2的表達(dá)抑制SREBPs的活化[38]。這與本實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到的HFD組BMAL1 mRNA表達(dá)量顯著低于CON組，蝦青素干預(yù)后極顯著恢復(fù)相似。通過(guò)這一證據(jù)可以推測(cè)，蝦青素對(duì)生物鐘的調(diào)節(jié)作用也許與蝦青素能增強(qiáng)PPARα的活力有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究了蝦青素對(duì)NAFLD的干預(yù)作用，并觀(guān)察了蝦青素對(duì)高脂所致節(jié)律紊亂的改善作用。為進(jìn)一步研究蝦青素的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)及其節(jié)律調(diào)節(jié)作用提供了依據(jù)。