不同熱處理溫度對(duì)生物解離提油后大豆乳狀液穩(wěn)定性的影響

李 紅，齊寶坤，鐘明明，朱建宇，孫禹凡，胡 淼，王 歡，李 楊*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

傳統(tǒng)大豆油脂的制取方式主要是采用機(jī)械壓榨法和溶劑浸出法，其中多數(shù)為溶劑浸出法，但是隨著研究的進(jìn)行，人們發(fā)現(xiàn)了一種綠色、環(huán)保的新技術(shù)——水酶法/生物酶法。生物解離提取技術(shù)是一種同時(shí)從油料種子中提取油脂和蛋白質(zhì)的方法，該方法所得的產(chǎn)品品質(zhì)高，極適合人類食用。雖然生物解離有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是由于酶解處理時(shí)間長(zhǎng)（通常在2～3 h），酶處理后干燥過(guò)程的成本比較高，所以生物解離技術(shù)的應(yīng)用還存在一定的限制。并且在生物解離提油過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)不可避免的乳化現(xiàn)象，大部分大豆油脂殘留在由大豆蛋白和油脂構(gòu)成的乳狀液體系中[1]，導(dǎo)致其包裹的油脂難以從由蛋白與油脂緊密結(jié)合形成的穩(wěn)定乳狀液中被釋放分離，因而限制了油脂的提取率[2]。因此，如何采用高效、綠色、安全的破乳方法將乳狀液中的油脂釋放出來(lái)成為提高生物解離油脂提取率的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

熱處理破乳法通過(guò)增加分子的熱運(yùn)動(dòng)使乳狀液中的微油脂顆粒聚結(jié)，此外，由于溫度升高時(shí)乳狀液黏度降低，進(jìn)一步降低了乳狀液的穩(wěn)定性，并達(dá)到破乳目的。Chabrand等[3]的研究表明，在生物解離提取大豆油脂的過(guò)程中所形成的乳狀液表面吸附蛋白含量為（11.40±0.35）mg/m2。相比于水劑法提取技術(shù)中形成的乳狀液吸附蛋白含量（14.65 mg/m2）有所降低[4]。王文睿等[5]采用水浴和油浴加熱破乳的工藝，優(yōu)化了工藝參數(shù)，在加熱溫度為120 ℃、加熱時(shí)間為15 min時(shí)，其優(yōu)化的破乳率為90.76%。此外，Campbell等[2]也對(duì)乳狀液進(jìn)行了加熱破乳研究，其將乳狀液在95 ℃下加熱30 min，也達(dá)到了初步破乳的效果。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)乳狀液的破乳技術(shù)進(jìn)行了研究，但對(duì)乳狀液結(jié)構(gòu)特征的研究并不透徹。

因此，本研究在用不同溫度熱處理大豆乳狀液中，通過(guò)ζ-電位、粒徑分布、顯微觀察分析乳狀液的穩(wěn)定性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜分析蛋白質(zhì)變化，明確不同熱處理溫度大豆乳狀液結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性之間的構(gòu)效關(guān)系，探究乳狀液體系中各組分的分子間作用力和組成以及空間構(gòu)象。從而開(kāi)發(fā)新型、高效的破乳技術(shù)，為生物解離提取大豆油脂產(chǎn)業(yè)化提供理論參考及應(yīng)用指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；Protex 6L堿性蛋白酶 杰能科生物工程有限公司；SDS、β-巰基乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉鹽酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、氫氧化鈉、丙酮、無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 紹興科宏儀器有限公司；擠壓膨化機(jī) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；LGJ-1冷凍干燥機(jī)上海醫(yī)用離心機(jī)廠；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀、Mastersizer 2000粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)Leica公司；TNZ1-5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；F2000熒光光譜儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 生物解離大豆乳狀液的制備

參照齊寶坤[6]的方法并適當(dāng)修改。大豆粉碎后擠壓膨化預(yù)處理，得到膨化大豆粉。膨化大豆粉與水混合（料液比1∶6），加入Protex6L堿性蛋白酶，攪拌均勻后在60 ℃水浴鍋中保持恒溫加熱，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，酶解3 h后取出，于100 ℃沸水中滅酶10 min，在4 500 r/min下離心20 min，吸取游離油，將其余液體部分倒入分液漏斗，靜置24 h分層，將乳狀液分離。

1.3.2 乳狀液的熱處理

稱取20 g酶解后的原始乳狀液，分別在不同的溫度條件（55、65、75、85、95 ℃）下加熱1 h，然后在3 585 r/min離心10 min，分離乳狀液和水相。

1.3.3 乳狀液分層系數(shù)和游離油得率的測(cè)定

取8 mL處理后的乳狀液于離心管中，在4 ℃貯藏24 h，乳狀液發(fā)生分層現(xiàn)象，上相渾濁、下相澄清。分層系數(shù)、游離油得率的計(jì)算分別見(jiàn)公式（1）、（2）。

1.3.4 乳狀液粒徑及ζ-電位的測(cè)定

采用激光光散射粒度儀測(cè)定乳狀液體積平均粒徑（D4,3）和表面積平均粒徑（D3,2），將小部分乳狀液分散在50 mL蒸餾水中，保持粒徑數(shù)值在測(cè)定范圍內(nèi)，大豆油滴的折射指數(shù)（refractive index，RI）為1.470，分散劑的RI為1.333。

采用Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀測(cè)定乳狀液溶液的ζ-電位。用0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將大豆乳狀液樣品稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液后進(jìn)行測(cè)定，上樣體積1 mL，測(cè)定溫度25 ℃。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3 次。

1.3.5 乳狀液激光共聚焦顯微鏡觀察

采用Ar/K和He/Ne雙通道激光模式，激發(fā)光的波長(zhǎng)分別是488 nm和633 nm。分別將0.01 mg/mL尼羅紅和0.01 mg/mL尼羅藍(lán)溶解在異丙醇中，制成染色液。取1 mL乳狀液樣品，分別加入400 μL 0.01 mg/mL尼羅紅染色液和尼羅藍(lán)染色液，混合均勻后染色20 min，取1 滴染色后的乳狀液樣品置于帶凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片并用甘油密封。采用油鏡進(jìn)行圖像的采集，分辨率為1 024h1 024，圖像采集的范圍為5～45 μm。

1.3.6 乳狀液流變的測(cè)定

采用流變儀測(cè)定乳狀液的流變學(xué)變化。剪切速率為5 s－1，升溫速率為5 ℃/min，觀察此時(shí)乳狀液的黏度隨溫度的變化規(guī)律。在25 ℃下，采用流變儀觀察黏度隨剪切速率的變化規(guī)律。在線性黏彈區(qū)域內(nèi)，測(cè)定乳狀液樣品的彈性模量G′隨振蕩頻率的變化規(guī)律。選擇平行板測(cè)試系統(tǒng)，其平行板的間距為1 mm，直徑為40 mm[7]。

1.3.7 乳狀液中蛋白質(zhì)的提取

乳狀液水相中蛋白質(zhì)提取采用丙酮沉淀法[8]，用冰丙酮按照20 g/L在－18 ℃下反應(yīng)2 h，4 ℃ 12 000hg離心分離15 min，除去上清液，將沉淀繼續(xù)用冷丙酮洗滌4～5 次，直到溶劑由黃色變成無(wú)色，沉淀中溶劑揮發(fā)后凍干得到蛋白，放入4 ℃冰箱備用。

1.3.8 SDS-PAGE分析

乳狀液的處理參照文獻(xiàn)[9]的方法，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，上樣質(zhì)量濃度1 mg/mL，上樣量為10 μL，上樣前將樣品先在95 ℃下加熱5 min。初始電流為10 mA，樣品進(jìn)入分離膠后改為20 mA。分離后先染色再脫色。

1.3.9 表面疏水性的測(cè)定

依據(jù)Laemmli[10]的方法，采用8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）熒光探針?lè)?。稱取0.025 g不同處理方式下的蛋白樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液中，配成pH 7、0.01 mol/L的溶液，將溶液在室溫下攪拌混合1 h，然后在10 000hg下離心30 min，取上清液采用Lowry法測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度，并用上述磷酸鹽緩沖液依次稀釋后，使其濃度在0.005～0.500 mol/mL之間。取不同濃度樣品溶液4 mL，分別加入40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液，經(jīng)振蕩混合后靜置5 min，再測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490 nm，夾縫寬度為5 nm。對(duì)熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品粉碎后過(guò)100 目篩，粉末在40 ℃烘箱中烘干12 h，然后在紅外燈下進(jìn)行研磨處理。稱取約2 mg待測(cè)樣品，加入200 mg溴化鉀，在瑪瑙研缽中研磨15 min，隨后進(jìn)行壓片處理，壓片機(jī)在14 kg壓力下約保持1 min，然后將制得的均勻透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的條件為：掃描范圍400～4 000 cm－1，分辨率為4 cm－1，掃描信號(hào)累加64 次。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

譜圖的分析處理采用Peakfit軟件，在酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）進(jìn)行兩點(diǎn)基線校正，然后再采用Savitsk-Go1ay函數(shù)進(jìn)行平滑處理，求二階導(dǎo)數(shù)，并采用Gauss峰形進(jìn)行擬合，估算出子峰的個(gè)數(shù)與位置，經(jīng)過(guò)手動(dòng)調(diào)整各子峰的峰高和半峰寬進(jìn)行多次擬合使得殘差最小，確定各子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其積分面積計(jì)算出4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.11 熒光光譜分析

依據(jù)尹壽偉[11]的方法，采用F2000熒光光譜議測(cè)定乳狀液分離出的大豆蛋白的色氨酸熒光光譜。將大豆蛋白樣品分別分散于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，配制蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的溶液。熒光發(fā)散光譜分析以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的色氨酸熒光基團(tuán)為探針，為了降低酪氨酸的貢獻(xiàn)，熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，光譜的掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫的寬度均為5 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每組實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3 次平行，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用SPSS 18軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理溫度下乳狀液分層系數(shù)和游離油得率分析

圖1 不同溫度下乳狀液的分層系數(shù)和游離油得率Fig.1 Creaming index and free oil yield of the emulsion treated at different temperatures

如圖1所示，隨著熱處理溫度的升高，分層系數(shù)和游離油得率呈增加趨勢(shì)。當(dāng)熱處理溫度為85 ℃以上時(shí)，分層系數(shù)和游離油得率明顯增加。加熱溫度為95 ℃時(shí)，分層系數(shù)和游離油得率達(dá)到最大，分別為42%和81%左右。大豆乳狀液的失穩(wěn)是熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)受熱變性引起油滴聚集導(dǎo)致的。大豆中的蛋白質(zhì)對(duì)乳狀液的穩(wěn)定起著重要的作用，高溫加熱能夠使蛋白質(zhì)變性。Kwon等[12]的研究表明，大豆乳狀液中蛋白質(zhì)在80 ℃以上會(huì)發(fā)生變性和凝聚。乳狀液中蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性會(huì)使油滴表面電荷降低，具有低表面電荷的油滴相互靠近導(dǎo)致乳狀液分層，油滴聚集形成大油滴。由于聚集形成大油滴和施加的外力離心力的作用，會(huì)使乳狀液破乳，導(dǎo)致相分離形成油層和水層[13]。因此，熱處理溫度超過(guò)85 ℃時(shí)會(huì)使大多數(shù)蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致乳狀液破乳并釋放出油脂。

2.2 不同熱處理溫度下乳狀液ζ-電位分析

圖2 不同熱處理溫度下乳狀液ζ-電位（A）、粒度分布（B）與平均粒徑（C）的變化Fig.2 Zeta potential (A), particle size distribution (B) and average particle size (C) of the emulsion treated at different temperatures

如圖2所示，乳狀液ζ-電位在75 ℃以下時(shí)沒(méi)有明顯變化，粒度分布呈單峰，主要分布在0.5～100 μm。當(dāng)加熱到85 ℃時(shí)，乳狀液ζ-電位明顯增加，在10～100 μm范圍分布的液滴明顯增多。95 ℃熱處理乳狀液ζ-電位最大，粒度分布峰向大粒徑方向移動(dòng)，并且在大于100 μm的粒徑區(qū)域也有少量的分布，平均粒徑達(dá)到最大，其D4,3值為（14.79±0.64）μm，并且發(fā)生絮凝作用，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低，而D3,2值變化不明顯。ζ-電位的變化表明乳狀液周?chē)缑鎸拥慕M成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些改變[14]。一般來(lái)說(shuō)，球蛋白穩(wěn)定的乳狀液易受熱處理溫度等不穩(wěn)定因素的影響，大多數(shù)球蛋白容易發(fā)生熱誘導(dǎo)變性[15]。此外，高溫還會(huì)破壞乳狀液界面層的組成和結(jié)構(gòu)，使油脂體表面電荷減少，液滴之間的靜電相互作用增大。通過(guò)靜電相互作用產(chǎn)生的吸引力能夠引起液滴的凝沉和聚集，導(dǎo)致乳狀液粒徑增大。然而，Chiang等[16]發(fā)現(xiàn)其他植物來(lái)源的天然或人造乳狀液具有較好的熱穩(wěn)定性，這表明對(duì)球蛋白穩(wěn)定油滴形成的乳狀液進(jìn)行熱處理后，不會(huì)引起乳狀液表面性質(zhì)的顯著改變。Nikiforidis等[17]對(duì)玉米胚芽乳狀液的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果與本研究不同，他發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米胚芽乳狀液進(jìn)行熱處理后其粒徑變化不顯著，這可能與熱處理溫度低于70 ℃有關(guān)。本研究的熱處理溫度設(shè)置在55～95 ℃，當(dāng)加熱到85 ℃和95 ℃時(shí)，溫度高于油脂體蛋白的變性溫度（60～75 ℃），乳狀液ζ-電位與D4,3值才發(fā)生顯著變化，破壞了界面層的組成和結(jié)構(gòu)，使油脂體表面電荷急劇減少，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低。

2.3 不同熱處理溫度下乳狀液激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

圖3 不同熱處理溫度下乳狀液的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果Fig.3 Confocal laser scanning microscopic images of the emulsion treated at different temperatures

乳狀液的液滴分布、形態(tài)以及微觀結(jié)構(gòu)變化可以直接由激光共聚焦顯微鏡觀察。從圖3中可以看出紅色的油相和綠色的蛋白相的分布情況，熱處理溫度對(duì)乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)具有顯著影響。當(dāng)熱處理溫度為55～75 ℃時(shí)沒(méi)有破壞乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，油滴尺寸和分布情況沒(méi)有顯著改變；當(dāng)熱處理溫度達(dá)到85～95 ℃時(shí)，油滴尺寸明顯增加，出現(xiàn)了更多的大油滴，且部分蛋白質(zhì)受熱形成聚集體，這說(shuō)明高溫破壞了乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小油滴聚集形成大油滴。這可能與蛋白質(zhì)的變性溫度有關(guān)，加熱溫度達(dá)到85 ℃以上后，能夠使乳狀液中大部分蛋白質(zhì)變性，從而使蛋白質(zhì)失去原有的乳化能力，破壞了乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致油滴聚集。因此，對(duì)乳狀液進(jìn)行85 ℃以上的熱處理可以有效破壞乳狀液的穩(wěn)定體系，進(jìn)而達(dá)到回收油脂的目的。

2.4 不同熱處理溫度下乳狀液的流變性分析

圖4 不同溫度下乳狀液黏度與剪切速率的關(guān)系Fig.4 Correlation between viscosity and shear rate of the emulsion treated at different temperatures

由圖4可知，隨著剪切速率的增加，所有熱處理溫度條件下乳狀液的黏度逐漸降低，最終達(dá)到平衡，表現(xiàn)為剪切變稀的性質(zhì)，為典型的假塑性流體。在低剪切速率下，乳狀液黏度急劇下降；在高剪切速率下，乳狀液黏度幾乎沒(méi)有變化，這與原始乳狀液的變化趨勢(shì)（未在圖中顯示）相似。熱處理溫度為55 ℃的乳狀液黏度隨著剪切速率的增加下降得最慢，且最終黏度最大。隨著熱處理溫度的升高，乳狀液黏度下降速率逐漸加快，且最終黏度也逐漸降低，表明剪切變稀行為加劇。在熱處理溫度為55～75 ℃時(shí)這種變化不明顯，而當(dāng)熱處理溫度升高到85 ℃和95 ℃時(shí)，乳狀液黏度下降速率明顯增加，最終黏度明顯下降。這說(shuō)明高溫處理導(dǎo)致乳狀液剪切變稀行為加劇，降低了乳狀液的黏度，乳狀液黏度的降低促進(jìn)了液滴的移動(dòng)，使小液滴易于聚集成大液滴，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性下降[18]。此外，這也可能與超過(guò)85 ℃的高溫處理促使乳狀液中蛋白質(zhì)變性有關(guān)。因此，對(duì)乳狀液進(jìn)行高溫處理可以達(dá)到破乳的目的。

2.5 不同熱處理溫度乳狀液中的蛋白質(zhì)特性分析

2.5.1 不同熱處理溫度下乳狀液表面疏水性分析

圖5 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of the emulsion treated at different temperatures

蛋白質(zhì)分子重要的表觀特征之一就是疏水性，蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的變化可以由表面疏水性反映，這也是反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的一個(gè)重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)多肽鏈的展開(kāi)、亞基的解離等都可以導(dǎo)致其表面疏水性的增加，而蛋白質(zhì)聚集形成的可溶性或不可溶性聚集體會(huì)導(dǎo)致其表面疏水性的降低。如圖5所示，熱處理會(huì)使乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性降低。熱處理溫度由55 ℃升高到95 ℃，乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)由（292.40±5.06）降低至（146.60±4.95）。Sorgentini等[19]對(duì)熱處理過(guò)程中大豆分離蛋白表面疏水性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)使蛋白質(zhì)多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)伸展，暴露出埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性升高，這與本研究中得到的熱處理會(huì)使乳狀液蛋白質(zhì)表面疏水性降低的結(jié)果有所不同。其原因可能是由于乳狀液經(jīng)過(guò)熱處理后，蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性而暴露出內(nèi)部的疏水殘基，亞基之間通過(guò)疏水相互作用而發(fā)生聚集，形成可溶性或不可溶性的聚集體，這些聚集體會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域產(chǎn)生屏蔽作用，阻礙了疏水基團(tuán)與熒光探針ANS的有效結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性下降[20]。此外，乳狀液由55 ℃升高到75 ℃過(guò)程中，蛋白質(zhì)的表面疏水性變化不明顯，當(dāng)溫度超過(guò)85 ℃后，其表面疏水性明顯降低，在95 ℃時(shí)降至最低，這可能與85 ℃超過(guò)了乳狀液中蛋白質(zhì)的變性溫度有關(guān)。當(dāng)處理溫度超過(guò)蛋白質(zhì)變性溫度時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生明顯的熱聚集，引起其表面疏水性的明顯降低。

2.5.2 不同熱處理溫度下的SDS-PAGE分析結(jié)果

圖6 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE patterns of proteins in the emulsion treated at different temperatures

SDS-PAGE常用于蛋白質(zhì)亞基組成和結(jié)構(gòu)的分析，是蛋白質(zhì)亞基常用的檢測(cè)手段[21]。由圖6可知，乳狀液中蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量主要分布在11～63 kDa，在分子質(zhì)量小于11 kDa處還分布一部分小分子質(zhì)量亞基。熱處理溫度為55 ℃的乳狀液蛋白亞基主要分布在11、20 kDa和35～48 kDa處；當(dāng)熱處理溫度升高到65 ℃時(shí)，分子質(zhì)量為20 kDa的亞基消失了，這可能是由于20 kDa的亞基對(duì)熱敏感，熱處理導(dǎo)致其分解造成的[22]。75 ℃和65 ℃熱處理的乳狀液蛋白的亞基分布幾乎沒(méi)有差別，當(dāng)熱處理溫度升高到85 ℃時(shí)，在35～48 kDa處分布的亞基分子質(zhì)量增大；在95 ℃時(shí)亞基分子質(zhì)量增大得更明顯，這可能是由于高溫處理使乳狀液中蛋白質(zhì)亞基聚集，導(dǎo)致分子質(zhì)量的增大[23]。85 ℃以上熱處理溫度達(dá)到了乳狀液蛋白的變性溫度，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生熱變性聚集，導(dǎo)致其分子質(zhì)量增大，這也與本研究中熱處理對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響的分析結(jié)果相符。

2.5.3 不同熱處理溫度下傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖7 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 Fourier transform infrared spectra of proteins in the emulsion treated at different temperatures

傅里葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)能夠揭示蛋白質(zhì)在特定環(huán)境中的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。由圖7可知，乳狀液由55 ℃加熱到95 ℃過(guò)程中，蛋白質(zhì)的傅里葉變換紅外光譜發(fā)生明顯改變。隨著熱處理溫度的升高，乳狀液中蛋白質(zhì)的紅外特征吸收峰強(qiáng)度逐漸增加，在加熱到75 ℃以上時(shí)吸收峰增加明顯。這些吸收峰位置為C—O—C鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生吸收峰的1 000～1 260 cm－1處，芳香族中C—H鍵彎曲振動(dòng)產(chǎn)生吸收峰的1 400～1 600 cm－1處[24]，üCH3和—CH2基團(tuán)中C—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生吸收峰的2 800～3 000 cm－1處[25]，—OH基伸縮振動(dòng)產(chǎn)生吸收峰的3 300 cm－1附近[26]。

表1 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table1 Secondary structure contents of proteins in the emulsion treated at different temperatures

原始乳狀液的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為：α-螺旋含量（17.3±0.1）%、β-折疊含量（40.9±0.2）%、β-轉(zhuǎn)角含量（18.4±0.1）%、無(wú)規(guī)卷曲含量（23.4±0.1）%。由表1可知，乳狀液經(jīng)熱處理后其蛋白質(zhì)α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加，β-轉(zhuǎn)角含量變化不顯著，無(wú)規(guī)卷曲含量增加，且這種變化趨勢(shì)隨著熱處理溫度的升高而更加明顯。這說(shuō)明乳狀液經(jīng)熱處理后，蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，這可能是蛋白質(zhì)受熱變性導(dǎo)致的[27]。隨著熱處理溫度的升高，蛋白質(zhì)的熱變性程度進(jìn)一步增加，導(dǎo)致更多的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)為α-螺旋含量降低，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲含量增加。然而，熱處理溫度超過(guò)85 ℃以后，乳狀液中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化不顯著（P＞0.05），這可能與蛋白質(zhì)已經(jīng)完全變性有關(guān)。Chakraborty等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在受熱變性時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量會(huì)減少，β-折疊結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量會(huì)增加。Kim等[29]發(fā)現(xiàn)熱處理能夠使β-乳球蛋白乳狀液發(fā)生巰基-二硫鍵轉(zhuǎn)換。Zhai Jiali等[30]發(fā)現(xiàn)在76 ℃下對(duì)β-乳球蛋白乳狀液進(jìn)行熱處理，其發(fā)生了構(gòu)象改變，但是這種構(gòu)象改變沒(méi)有溶液中蛋白質(zhì)的變化明顯，與本研究結(jié)果一致。

2.5.4 不同熱處理溫度下色氨酸內(nèi)源熒光光譜分析

圖8 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光光譜圖（A）、熒光強(qiáng)度和最大吸收波長(zhǎng)（B）Fig.8 Intrinsic fl uorescence spectra (A), fl uorescence intensity and λmax (B) of the protein in the emulsion treated at different temperatures

在色氨酸內(nèi)源熒光光譜中，光能夠在90°入射角使樣品成為激發(fā)態(tài)。當(dāng)大量的光被乳狀液吸收或發(fā)散，探測(cè)器能夠檢測(cè)到很弱的熒光信號(hào)。設(shè)定入射角在30°～60°之間，一部分光能夠反射到檢測(cè)器中獲得較強(qiáng)的光信號(hào)[31]。色氨酸熒光光譜已被普遍用于研究乳狀液中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[32]。由圖8可知，乳狀液由55 ℃加熱到95 ℃過(guò)程中，蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度由（373.1±8.3）逐漸降低至（201.8±6.2），發(fā)生了熒光猝滅作用，這可能是由于熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)色氨酸殘基周?chē)h(huán)境變化導(dǎo)致的[33]。最大吸收波長(zhǎng)（λmax）與熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)相反，隨著熱處理溫度由55 ℃升高到95 ℃，蛋白質(zhì)的λmax逐漸增大，由（343.8±0.2）nm增大到（348.7±0.2）nm，即λmax發(fā)生紅移。乳狀液由55 ℃升高到75 ℃，蛋白質(zhì)的λmax變化不明顯，當(dāng)溫度超過(guò)85 ℃后，λmax發(fā)生明顯紅移，這可能與85 ℃超過(guò)了乳狀液中蛋白質(zhì)的變性溫度有關(guān)。當(dāng)熱處理溫度超過(guò)蛋白質(zhì)的變性溫度后，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展，暴露出原本埋藏在內(nèi)部的疏水基團(tuán)，使色氨酸殘基周?chē)h(huán)境的極性增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變。當(dāng)溫度達(dá)到95 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)完全變性，使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)更多的暴露到分子表面，且λmax紅移程度增加，此時(shí)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加松散。晏華立等[34]對(duì)麻瘋樹(shù)核糖體失活蛋白（curcin）熒光光譜的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度高于curcin的變性溫度時(shí)，可能導(dǎo)致curcin中色氨酸殘基的疏水核心結(jié)構(gòu)出現(xiàn)暴露在外的變性過(guò)程，引起色氨酸的特征吸收峰紅移，這與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)生物解離技術(shù)提取大豆乳狀液，探討不同熱處理溫度（55、65、75、85、95 ℃）對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響，從宏觀到微觀逐步探究了乳狀液體系中各組分的分子間作用力、組成以及空間構(gòu)象，得到主要結(jié)論如下：1）隨著溫度的增加，乳狀液的ζ-電位、平均粒徑和黏度均增加，95 ℃熱處理時(shí)油滴尺寸明顯增加，出現(xiàn)了更多的大油滴，這說(shuō)明高溫破壞了乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小油滴聚集形成大油滴；2）熱處理溫度低時(shí)，乳狀液蛋白的亞基分布幾乎沒(méi)有差別，當(dāng)熱處理溫度升高到85 ℃時(shí)亞基分子質(zhì)量增大，在溫度為95 ℃時(shí)亞基分子質(zhì)量增大更明顯，說(shuō)明乳狀液經(jīng)熱處理后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，且這種變化趨勢(shì)隨著熱處理溫度的升高而更加明顯；3）隨著熱處理溫度的升高，蛋白的熒光強(qiáng)度降低，發(fā)生了熒光猝滅作用，乳狀液的游離油得率升高。