木槿花生物活性物質(zhì)及其抗氧化活性分析

黃采姣，李安平,*，李建周，王曉紅

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.特醫(yī)食品加工湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004）

木槿（Hibiscus syriacus Linn.）屬錦葵科木槿屬落葉灌木，又名木錦、籬障花，因其易栽培、品種多、花色漂亮，我國大部分地區(qū)均有種植。木槿花有清熱、利濕、涼血等功能，且色澤艷麗、肉質(zhì)肥厚、口感清香、順滑爽口、無異味，在廣東和福建等地均有食用的習(xí)俗[1-2]。有研究表明，木槿花具有較高的營養(yǎng)價值，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、VC、粗纖維、礦物質(zhì)等，還含有豐富的多酚類物質(zhì)[3-5]。

近年來國內(nèi)外對木槿的研究主要集中在其品種選育、病蟲害防治和花卉的營養(yǎng)成分含量等方面[6-8]，而關(guān)于木槿花的生物活性少見文獻報道。多酚和黃酮類化合物廣泛存在于植物花卉中，是一種天然抗氧化劑，是目前的研究熱點之一。張福娣等[9]的研究表明扶?；ㄉ鼐哂休^強的抗氧化活性，且其抗氧化活性隨濃度的增大而增強；李曉英等[10]比較了藍莓花、莖、葉酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性，結(jié)果表明藍莓葉和花的抗氧化物質(zhì)分別主要是綠原酸和蘆丁。本研究對不同品種木槿花的抗氧化活性和生物活性物質(zhì)含量進行測定，并考察其相關(guān)性，鑒定木槿花的活性物質(zhì)成分，為木槿花的深加工和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫玉（Hibiscus syriacus. cv. Shigyoku）、薰衣草薄綢（Hibiscus syriacus. cv. Lavandula Chiffon）采自中南林業(yè)科技大學(xué)苗圃；木槿原種（Hibiscus syriacus L.）、雅致木槿（Hibiscus syriacus f. elegantissimus）采自益陽木槿基地；粉紫重瓣木槿（Hibiscus syriacus f.paeonif l orus）采自長沙跳馬鎮(zhèn)木槿基地。

沒食子酸、水溶性VE（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、蘆丁、三吡啶三吖嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine，TPTZ）、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）（分析純） 美國Sigma公司；福林-酚試劑北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；硫酸亞鐵、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷（均為分析純）、乙腈、甲酸（均為色譜純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QE100型高速萬能粉碎機 浙江屹立工貿(mào)有限公司；YRE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-1800型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；LGJ10型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；JY98-IIIN型超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；TGL-16型醫(yī)用離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、G2-XSQ-TOF型質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 木槿花提取液的制備

將新鮮木槿花置于55 ℃干燥箱中干燥18 h，冷卻后粉碎過60 目篩，得木槿花樣品。準(zhǔn)確稱取木槿花樣品1.00 g，按料液比1∶36加入體積分數(shù)70%乙醇溶液混合，避光浸泡20 min，然后用21 kHz超聲波輔助提取49 min，離心15 min，取上清液，殘渣按相同條件重復(fù)提取2 次，合并上清液，用溶劑定容至250 mL，測定各成分含量及其抗氧化活性。

1.3.2 不同溶劑萃取液的制備

稱取25.00 g木槿花樣品，按1.3.1節(jié)方法制取木槿花提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除乙醇，得粗提液。用X-5大孔樹脂純化，向純化液中加入等體積石油醚，充分振蕩后于分液漏斗中靜置萃取，得石油醚相和水相；在水相中再加入等體積的三氯甲烷，振蕩搖勻后分層，得三氯甲烷相和水相；按相同步驟，再在水相中依次加入乙酸乙酯和正丁醇，分別得到乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。每種溶劑重復(fù)萃取5 次。將相同溶劑萃取相合并，真空濃縮，水相冷凍干燥，得到不同溶劑木槿花萃取物。各組萃取相分離流程見圖1。

圖1 木槿花各組分萃取相分離流程Fig.1 Flow chart of sequential solvent fractionation extract from hibiscus fl ower

1.3.3 總酚、總黃酮、花青素含量的測定

總酚含量測定參照Marialeonoralotisd等[11]的方法并略作調(diào)整。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品（0～12 μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品總酚含量回歸方程y＝107.66x＋0.064 2（R2＝0.996）。總酚含量表示為每毫克樣品中相當(dāng)?shù)臎]食子酸質(zhì)量，以干物質(zhì)計。

采用硝酸鋁比色法[12]測定樣品中總黃酮含量。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品（0～0.1 mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品總黃酮含量回歸方程y＝12 057x＋0.003（R2＝0.999 7）?？傸S酮含量表示為每毫克樣品中相當(dāng)?shù)奶J丁質(zhì)量，以干物質(zhì)計。

采用pH示差法[13]測定樣品中花青素含量。取待測液1 mL，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液定容至10 mL，分別測定兩種溶液在700 nm和510 nm波長處的吸光度。以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，花青素含量表示為每毫克樣品相當(dāng)于矢車菊素-3-葡萄糖苷的質(zhì)量，以干物質(zhì)計，按公式（1）計算。

式中：A＝（A510nm－A700nm）pH1.0－（A510nm－A700nm）pH4.5；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449.2 g/mol）；DF為稀釋倍數(shù)（10）；V為樣品提取液總體積/mL；ε為樣品中矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)（26 900 L/（molgcm））；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

參照鄭時蓮[14]、Moon[15]等的方法并稍作修改。取1.0 mL樣品提取液與3.0 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）混勻，避光反應(yīng)30 min后，以無水乙醇為空白對照，于517 nm波長處測定樣品的吸光度。根據(jù)Trolox對DPPH自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的DPPH自由基清除能力以每克樣品提取液具有相同抗氧化能力所需Trolox的質(zhì)量表示。DPPH自由基清除率計算如式（2）所示。

式中：AI為1 mL提取溶劑與3 mL DPPH溶液混合后在517 nm波長處的吸光度；AII為1 mL樣品提取液與3 mL DPPH溶液混合后在517 nm波長處的吸光度；AIII為1 mL樣品提取液與3 mL無水乙醇在517 nm波長處的吸光度。

1.3.5 總還原能力的測定

參照Benzie等[16]的方法并稍作調(diào)整?？傔€原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定的溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，將15 mL 300 mmol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液、1.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液、1.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液混合，用前預(yù)熱至37 ℃。根據(jù)不同濃度FeSO4溶液做FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的FRAP以達到同樣吸光度變化（△A）所需的FeSO4溶液的物質(zhì)的量表示。取30 μL樣品，加入90 μL雙蒸水和0.9 mL FRAP溶液，混勻后在37 ℃反應(yīng)10 min，立即測定593 nm波長處吸光度。每個樣品平行測定3 次，△A越大說明FRAP越強。

1.3.6 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基清除能力參考Re等[17]的方法并稍作修改。ABTS母液的配制：準(zhǔn)確稱取0.038 4 g ABTS，用雙蒸水配制成10 mL濃度為7 mmol/L的溶液，并加入0.176 mL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液，在37 ℃下避光反應(yīng)12～16 h制得ABTS母液，置于4 ℃保存。使用前將其用無水乙醇稀釋，使其在732 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。將0.2 mL樣品加到3.5 mL ABTS母液中反應(yīng)6 min后立即測定吸光度As，每個樣品重復(fù)3 次。取0.2 mL 70%乙醇溶液與3.5 mL ABTS母液混勻，作為空白對照組，測定其在732 nm波長處的吸光度，記為Ac。取0.2 mL待測樣品與3.5 mL無水乙醇混勻，相同條件下，測定其吸光度A0；ABTS自由基清除率計算如式（3）所示。

根據(jù)Trolox對ABTS自由基清除率做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的ABTS自由基清除能力以每克樣品提取液具有相同抗氧化能力所需Trolox的質(zhì)量表示。

1.3.7 活性物質(zhì)成分分析

稱取干燥的正丁醇萃取物，用超純水配成14 mg/mL溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC-MS/MS分析。

HPLC條件：C18色譜柱（250 mmh4.6 mm，0.5 μm）；流動相B：乙腈，流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸溶液。梯度洗脫條件為：0～4 min，10%流動相B；4～7 min，10%～15%流動相B；7～15 min，15%～35%流動相B；15～17 min，35%～100%流動相B；17～18 min，100%～10%流動相B；流速0.4 mL/min，檢測波長308 nm，進樣量5 μL，柱溫40 ℃。

MS條件：采用正離子模式；電噴霧離子源；干燥器溫度400 ℃；離子源溫度120 ℃；干燥氣流速10 L/min；噴霧氣壓力344 kPa；毛細管裂解電壓3.5 kV；錐孔電壓40 V；掃描范圍：m/z 100～1 200。根據(jù)各峰的保留時間、分子質(zhì)量以及特征結(jié)構(gòu)碎片，與文獻中的研究結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)品對照進行比對鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)測定3 次，結(jié)果用 ±s表示。采用Origin 9.0軟件作圖，SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，Pearson法進行相關(guān)性分析，單因素方差分析法進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種木槿花提取液中生物活性物質(zhì)含量

表1 不同品種木槿花提取液中總酚、總黃酮和花青素含量Table1 Contents of polyphenols, fl avonoids and anthocyanins extracted from different varieties of hibiscus fl owers mg/g

由表1可知，不同品種木槿花提取液的總酚、總黃酮和花青素含量具有顯著性差異（P＜0.05）。5 個品種木槿花提取液的總酚含量從高到低依次為木槿原種、粉紫重瓣木槿花、薰衣草薄綢木槿花、紫玉和雅致木槿，總黃酮含量從高到低依次為木槿原種、薰衣草薄綢木槿花、粉紫重瓣木槿花、紫玉和雅致木槿。5 個品種木槿花提取液中的總酚含量和總黃酮含量變化趨勢基本一致。木槿原種的總酚和總黃酮含量明顯高于其他4 個品種，分別達到了17.33 mg/g和12.68 mg/g，分別是雅致木槿（總酚和總黃酮含量分別為12.16、7.08 mg/g）的1.4 倍和1.8 倍。5 個品種木槿花提取液的花青素含量與木槿花的顏色深淺一致，顏色越深花青素含量越高[18]。5 個品種中薰衣草薄綢木槿花的顏色最深，花青素含量（3.31 mg/g）最高，木槿原種的顏色最淺，花青素含量只有1.10 mg/g，僅為薰衣草薄綢木槿花的1/3。

2.2 不同品種木槿花提取液抗氧化活性比較

表2 不同品種木槿花提取液抗氧化活性比較Table2 Antioxidant activity of hibiscus fl ower extracts from different varieties

從表2可以看出，5 種木槿花提取液的FRAP、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均存在顯著性差異（P＜0.05），且3 種方法測定的抗氧化活性變化規(guī)律具有一致性。5 種木槿花提取液抗氧化活性從高到低依次為木槿原種、薰衣草薄綢木槿花、粉紫重瓣木槿花、紫玉和雅致木槿。木槿花的抗氧化活性排序與表1顯示的總酚和總黃酮含量變化規(guī)律基本相同。此結(jié)果與徐穎等[19]對不同品種蘋果籽抗氧化活性的研究和白周亞等[20]對不同品種豇豆抗氧化活性研究結(jié)果一致，即總酚含量和總黃酮含量越高，相應(yīng)的抗氧化活性越強。

2.3 木槿花生物活性物質(zhì)含量與其體外抗氧化活性的相關(guān)性分析

表3 木槿花生物活性物質(zhì)含量與其體外抗氧化活性的相關(guān)性分析Table3 Correlations between bioactive contents and in vitro antioxidant activity of hibiscus fl ower extracts

大量研究表明，植物提取液的抗氧化活性與其生物活性物質(zhì)含量之間存在一定的相關(guān)性[21-22]。FRAP、ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力是常用的幾種抗氧化活性檢測方法。從表3可以看出，F(xiàn)RAP、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力間呈極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），說明這3 種方法能基本能夠一致地反映不同品種木槿花提取液的抗氧化活性?？傸S酮含量、總酚含量與FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力之間存在著極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.700、0.805、0.668和0.824、0.820、0.785。花青素含量與FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力間的相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。由此表明總黃酮和總酚在木槿花的抗氧化中起主要作用，而不是花青素。此結(jié)論與石雪萍等[23]將食用辛香料中的主要抗氧化作用歸因于黃酮類物質(zhì)和邵佩蘭等[24]將紅棗色素的抗氧化作用歸因于多酚和黃酮的結(jié)論類似。因此，總黃酮和總酚含量高的木槿原種具有較強的FRAP、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力。

2.4 不同極性溶劑木槿花萃取物抗氧化活性比較

表4 不同極性溶劑木槿花萃取物的抗氧化活性比較Table4 Antioxidant activity of fraction extracted with different polar solvents extract from hibiscus fl ower

按照圖1的流程，用不同極性溶劑對抗氧化活性最強的木槿原種提取液進行萃取。由表4可知，各溶劑萃取相均具有一定的抗氧化活性，且FRAP、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力檢測結(jié)果具有一致性，均表明正丁醇萃取相的抗氧化活性最強，分別達到6.16mmol/g、15.50 mg/g和40.71 mg/g，其次是乙酸乙酯萃取相和水萃取相，最弱的是氯仿萃取相。根據(jù)相似相溶原理，石油醚和氯仿極性較小，與多酚和黃酮類化合物的極性差異較大，因此萃取物較少，乙酸乙酯和正丁醇極性較大，萃取物中總酚和黃酮類化合物含量較高，相應(yīng)的抗氧化活性較強。張東京等[25]在研究梨的不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)高極性溶劑萃取物的抗氧化活性更強，與本研究結(jié)果相似。

2.5 活性物質(zhì)成分分析結(jié)果

圖2 木槿花正丁醇萃取物的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of the n-butanol extract from hibiscus fl ower

如圖2所示，在波長308 nm處各峰基本上得到了分離，主要含有8 個色譜峰。

由表5可知，木槿原種正丁醇萃取液中含有8 種化合物：山柰酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷、芹菜素、山柰酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷同分異構(gòu)體、芹菜素-C-二糖苷、芹菜素-葡萄糖芹糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、芹菜素-7-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3-丙二酰葡萄糖苷。

表5 各質(zhì)譜峰鑒定結(jié)果Table5 Identif i cation of all mass spectral peaks

1號峰的保留時間為2.937 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 611.16。在其二級質(zhì)譜中出現(xiàn)了m/z 449.11、413.00、353.07、329.06、299.06的碎片離子：其中m/z 449.11的碎片離子峰是分子離子峰m/z 611.16失去1 分子六碳糖；m/z 329.06為[M＋H－162－120]＋，即失去一個六碳糖基；m/z 287為[329－CH2-CO]＋，即為山柰酚的母環(huán)。參照文獻[26]推斷1號峰可能是山柰酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，證實為山柰酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷。

2號峰的保留時間為3.330 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 271.05。參考文獻[27]猜測其有可能是芹菜素。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，證實其為芹菜素。

3號峰的保留時間為4.590 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 611.16。其二級質(zhì)譜出現(xiàn)的m/z 449.11、413.00、353.07、329.06、299.06的碎片離子峰與1號峰幾乎一樣，因此推測3號峰可能是1號峰山柰酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷的同分異構(gòu)體[26]。

4號峰的保留時間為5.042 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 595.17。在其二級質(zhì)譜中產(chǎn)生了m/z 433.00、367.07、337.07、313.07、283.05的碎片離子峰，其中m/z 433.00為[M＋H－162]＋的碎片離子峰有可能是其分子離子峰丟失了一個六碳糖所致，m/z 313.07可能是m/z 433.00失去一個以碳苷鍵連接的六碳糖而產(chǎn)生，依此推斷母核離子應(yīng)為芹菜素m/z 271.05即[313－CH2-CO]＋，參考文獻[26]推測該物質(zhì)可能是芹菜素-C-二糖苷。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，證實其為芹菜素-C-二糖苷。

5號峰的保留時間為6.379 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 565.16。在二級質(zhì)譜中碎片離子峰m/z 295.00為分子離子峰m/z 565.16失去m/z 270.16的碎片所得，參照文獻[28]推測該碎片離子峰可能是芹菜素，因此推斷5號峰可能是芹菜素-葡萄糖芹糖苷。

6號峰的保留時間為8.094 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 595.16。在其二級質(zhì)譜中有m/z 287.05的碎片離子峰，此峰為山柰酚母環(huán)；m/z 433.11為分子離子峰m/z 595.16失去一個中性片段葡萄糖苷所致，參照文獻[29]推測其可能是山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

7號峰的保留時間為8.289 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 579.17。二級質(zhì)譜中產(chǎn)生了m/z 433.11、337.07、313.07、283.05的碎片離子峰，m/z 433.11的碎片離子峰有可能是分子離子峰丟失了m/z 146.06的中性片段鼠李糖苷所得，而[313－CH2-CO]＋即為芹菜素的母離子m/z 271.05，參考文獻[26]推測該物質(zhì)可能為芹菜素-7-O-蕓香糖苷。

8號峰的保留時間為10.576 min，其分子離子峰[M＋H]＋為m/z 535.10，二級質(zhì)譜中有m/z 287.05的碎片離子峰，該碎片離子峰有可能是分子離子峰丟失了m/z 248.05的丙二酰葡萄糖苷后剩下的矢車菊素的母離子，參考文獻[30]推測該物質(zhì)可能為矢車菊素-3-丙二酰葡萄糖苷。

以上8 種黃酮類化合物是木槿花正丁醇萃取液的主要成分，因此猜測黃酮類化合物是木槿花抗氧化活性的主要因子。

3 結(jié) 論

5 種木槿花均含有較多的多酚和黃酮類物質(zhì)，具有較強的抗氧化活性。不同木槿花品種的生物活性物質(zhì)含量與其抗氧化活性之間存在極顯著差異（P＜0.01）。5 種木槿花提取液抗氧化活性從高到低依次為木槿原種、薰衣草薄綢木槿花、粉紫重瓣木槿花、紫玉和雅致木槿。木槿原種是抗氧化活性最強的品種，也是目前國內(nèi)種植最廣泛的品種，這對木槿花的品種選育以及產(chǎn)品開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

通過相關(guān)性分析表明總酚含量、總黃酮含量與FRAP、DPPH自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。乙酸乙酯和正丁醇極性較大，萃取物中多酚和黃酮類化合物較多，相應(yīng)的抗氧化活性較高；石油醚和氯仿極性較小，與多酚和黃酮類化合物的極性差異較大，因此萃取出的多酚和黃酮類化合物較少。

通過HPLC-MS/MS對正丁醇萃取液進行綜合分析，初步鑒定出木槿原種花卉提取物正丁醇萃取物中抗氧化物質(zhì)包括：山柰酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷、芹菜素、山柰酚-O-六碳糖-C-六碳糖苷同分異構(gòu)體、芹菜素-C-二糖苷、芹菜素-葡萄糖芹糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、芹菜素-7-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3-丙二酰葡萄糖苷，均為黃酮苷類化合物。