生物胺降解菌在醬油中的應(yīng)用

程淑敏，藍(lán)翔，徐瑩，汪東風(fēng)，馬冉冉

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266001)

生物胺是一種存在于蛋白質(zhì)含量豐富的發(fā)酵食品中的一類含氮有機(jī)化合物，如發(fā)酵香腸、干酪、咸魚、魚露、醬油等[1]。適量的生物胺對細(xì)胞發(fā)揮正常的生理功能非常重要，其中有些是激素、生物堿、核酸或蛋白質(zhì)合成的前體[2]，有些生物胺對細(xì)胞的生長和分化以及基因調(diào)節(jié)有重要作用[3]。但是，當(dāng)生物胺在人體內(nèi)積累到較高的數(shù)量時就會出現(xiàn)一些諸如頭痛、惡心等中毒癥狀，嚴(yán)重時會危及生命[4]。醬油是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，原料中的蛋白質(zhì)在微生物的催化下水解成氨基酸等成分，造成了醬油獨(dú)特的風(fēng)味口感。但是因為發(fā)酵周期長、微生物群落復(fù)雜等特點(diǎn)，發(fā)酵過程中不可避免地會生成有害物質(zhì)，其中生物胺就是一類[5]。近幾年對市售醬油的生物胺調(diào)查顯示：成品醬油中普遍存在著8種生物胺，其中許多醬油的總生物胺含量已經(jīng)超過1 000 mg/kg[6-7]。而醬油是我國使用最廣泛的調(diào)味品，因此降低醬油中的生物胺具有重要的意義。

實(shí)驗室前期篩出了2株生物胺降解菌Wickerhamomycesanomalus和Millerozymafarinosa，在培養(yǎng)基中對8種生物胺具有較好的降解效果，本文欲初步探究這2株菌在醬油的發(fā)酵環(huán)境中的降解效果以及對醬油品質(zhì)的影響。探究在復(fù)雜環(huán)境中生物胺降解菌的降解效果，能為該菌株在食品中的擴(kuò)大應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

本實(shí)驗分離并保藏的2株生物胺降解菌(以下簡稱降胺菌)：W.anomalus(J2)、M.farinosa(J3)。實(shí)驗所用的醬油醪來自某釀造公司。

1.2 試劑

YPD培養(yǎng)基[8]、生物胺產(chǎn)生鑒別培養(yǎng)基[9](g/L)：胰蛋白胨5，酵母浸膏5，牛肉膏5，NaCl 2.5，葡萄糖0.5，Tween 80 1，MgSO40.2，MnSO40.05，F(xiàn)eSO40.04， 檸檬酸銨 2，硫胺素 0.01，K2HPO42，CaCO30.1，磷酸吡哆醛 0.05，前體氨基酸 0.1，溴甲酚紫 0.06，瓊脂20，調(diào)節(jié)pH=5.3。前體氨基酸、丹磺酰氯均購自Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純；脯氨酸、三乙胺、異硫氰酸苯酯、正己烷、DNS等為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器及設(shè)備

Kjeltec 2300型自動凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS分析儀器公司；ZDJ-4A型自動電位滴定儀，海儀分科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；YGC-12型氮吹儀，鄭州寶晶電子科技有限公司；HHBLL600-S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械；PHSJ-3F型酸度計，上海雷磁儀器廠；Agilent 1100型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；PHSJ-3F型數(shù)字pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司等。

2 試驗方法

2.1 發(fā)酵劑的準(zhǔn)備

將4 ℃斜面保藏的降胺菌經(jīng)斜面活化24 h后在28 ℃下液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株24 h；再以2%的接種量接種于含有3% NaCl的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h；置于4 ℃下4 000 r/min冷凍離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌1次再離心，收集菌體并適量稀釋，運(yùn)用血球計數(shù)法計數(shù)，菌懸液的接種濃度為106CFU/g，菌懸液保存于4 ℃的冰箱，當(dāng)天使用。

2.2 樣品采集

未發(fā)酵的醬油醪由某釀造公司提供。取樣200 mL于無菌瓶內(nèi)，-20 ℃冷藏待實(shí)驗。將2.1制備的降胺菌菌懸液加入發(fā)酵罐內(nèi)，空白組加入等量的無菌生理鹽水，每組3個平行。分別混合均勻，8層紗布封口，在28 ℃下發(fā)酵90 d。每次取樣時混合均勻，其余時靜置發(fā)酵，在0、5、10、20、40、60、90 d時取樣分析。

2.3 pH、TVB-N、氨基酸態(tài)氮的測定

pH的測定：使用數(shù)字pH計測定。揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定[10]：將1 mL樣品定容到100 mL，取10 mL在蒸餾瓶中，加入10 mL 1%的氧化酶懸浮液(1 g MgO溶于100 mL蒸餾水)，上機(jī)測定，結(jié)果以mg/100 mL表示[11]。氨基酸態(tài)氮測定：采用甲醛滴定法進(jìn)行測定[12]。

2.4 生物量的測定

樣品處理：取1.0 mL樣品，加入到含9.0 mL滅菌蛋白胨鹽溶液(0.1%蛋白胨，0.85% NaCl)的無菌試管中，混合均勻，10倍梯度稀釋，分別移取0.1 mL涂布相應(yīng)平板，按照以下條件培養(yǎng)?？偤醚跷⑸铮篜CA培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)24 h。生物胺產(chǎn)生菌：生物胺產(chǎn)生菌鑒別培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h。總好氧菌計數(shù)所有菌落，生物胺產(chǎn)生菌計數(shù)紫色菌落。選擇菌落數(shù)范圍為30～300個的平板進(jìn)行計數(shù)，按照稀釋倍數(shù)進(jìn)行換算，結(jié)果以lg CFU/mL表示。

2.5 生物胺的測定

采用高效液相色譜，丹磺酰氯柱前衍生法測定[13]。

2.6 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定采用的是高效液相PITC柱前衍生法[14]。量取 200 μL氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.002 5 mol/L)，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和 100 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，混勻，室溫反應(yīng)1 h，然后加入正己烷400 μL，旋緊蓋子后劇烈振蕩 5～10 s，靜置分層，取 200 μL下層溶液與 800 μL水混合，0.22 μm針式過濾器過濾，待分析。樣品的衍生方法與標(biāo)準(zhǔn)品相同。高效相液相色譜(HPLC)的分析條件：色譜柱為C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫40 ℃；流動相A: 0.1 mol/L乙酸鈉溶液(pH值為6.50±0.05)∶乙腈=93∶7(體積比)；流動相B∶V(水)∶V(乙腈)=20∶80；流速：1.0 mL/min：進(jìn)樣量：20 μL。樣品的梯度洗脫程序參考文獻(xiàn)[2]。

2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實(shí)驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。繪圖使用Microsoft office Excel 2007 軟件。

3 結(jié)果與討論

3.1 降胺菌對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中生物胺的影響

在發(fā)酵過程中不同時期的生物胺含量變化如圖1，在發(fā)酵的10 d內(nèi)，生物胺含量緩慢上升，空白組與實(shí)驗組在色胺、腐胺、組胺、酪胺含量之間沒有明顯差別，苯乙胺的空白組實(shí)驗含量低于實(shí)驗組，尸胺、酪胺、亞精胺、精胺的空白組含量高于實(shí)驗組。這一階段生物胺的總量變化不明顯，這可能是因為在發(fā)酵的初期，生物胺降解菌在環(huán)境中并沒有發(fā)揮作用，主要菌群仍然是醬油發(fā)酵菌群。在發(fā)酵40～90 d時，空白組與實(shí)驗組的8種生物胺含量出現(xiàn)了顯著性差異。由圖可看出J2在組胺、酪胺、亞精胺的降解方面優(yōu)于J3。結(jié)合總生物胺含量的變化可知：降解效果J2優(yōu)于J3。

3.2 對發(fā)酵過程pH的影響

降胺菌對醬油發(fā)酵過程中pH的影響如圖2所示。空白組與實(shí)驗組的pH隨著發(fā)酵時間的延長均不斷降低。在發(fā)酵的前10 d三組的pH差異不大。在發(fā)酵的前20 d pH下降較快，原因是在發(fā)酵的初始階段產(chǎn)酸微生物比較活躍，這些產(chǎn)酸的微生物代謝較多的乳酸及其他酸類物質(zhì)，有機(jī)酸類物質(zhì)在此階段生成速率增加，產(chǎn)酸較多，所以pH下降較快。在20 d之后，pH下降緩慢，pH從高到低依次為J3>J2>K,是因為在20 d之后的發(fā)酵時間里，生成的氨基酸等物質(zhì)會有少量轉(zhuǎn)化成堿性的揮發(fā)性鹽基氮類物質(zhì)，使得pH下降緩慢[15]。

a-色胺tryptamine(TRY);b-苯乙胺β-phenylethylamine(PHE);c-腐胺putrescine(PUT);d-尸胺cadaverine(CAD);e-組胺histamine(HIS);f-酪胺tyramine(TYR);g-亞精胺spermidine(SPD);h-精胺spermine(SPM)圖1 不同實(shí)驗組高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中生物胺的變化Fig.1 Changes of biogenic amines during fermentation of high-salt and dilute soy sauce in different experimental groups注：K-空白對照組；J2，J3-實(shí)驗組。下同。

圖2 不同實(shí)驗組菌株高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.2 Changes of pH levels of high salted diluted state fermentation soy sauces in different groups

醬油中的酸味主要來源于有機(jī)酸，當(dāng)pH為4.6～4.8時，被認(rèn)為適度的酸度能增加醬油風(fēng)味，產(chǎn)生爽口的感覺。經(jīng)過40 d發(fā)酵的醬油pH值為(4.5±0.3)。和傳統(tǒng)醬油pH(4.6～4.8)基本一致[16]。此外，影響pH變化的原因還有原料水解成含有羰基端的多肽，微生物細(xì)胞自溶，游離脂肪酸的積累等，如乳酸菌生長可利用葡萄糖和檸檬酸以及部分氨基酸產(chǎn)生乳酸及乙酸從而降低了pH值[17]。

3.3 對醬油發(fā)酵過程中TVB-N的影響

醬油發(fā)酵過程中TVB-N的變化如圖3所示。TVB-N是衡量水產(chǎn)品和水產(chǎn)制品腐敗變質(zhì)程度的質(zhì)量控制指標(biāo)，主要包括腐敗微生物生成的氨、三甲胺等含氮揮發(fā)性鹽基氮化合物[18]。由圖可看出空白組和實(shí)驗組的的TVB-N在發(fā)酵的前20 d上升較快，在20～40 d增加變緩，在發(fā)酵后期基本維持穩(wěn)定。這是因為醬油曲的細(xì)菌和酶使得蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生胺基氨類堿性含氮物質(zhì)，也可能是因為在發(fā)酵前期，腐敗微生物未被有效抑制，導(dǎo)致了TVB-N含量快速升高[19]。

圖3 菌株對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中TVB-N的影響Fig.3 Effect of bacteria on TVB-N during fermentation of high salt and dilute soy sauce

3.4 對醬油發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的影響

醬油中氨基酸態(tài)氮含量的多少，是衡量醬油品質(zhì)重要指標(biāo)之一[20]。本文采用甲醛滴定法，檢測氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時間的變化，結(jié)果如圖4所示，在發(fā)酵前20 d，氨基酸態(tài)氮增長率較快，含量很快高于0.4 g/100 mL，之后趨于平緩，在第60天左右時達(dá)到峰值。J2和J3的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于對照組，且2株降胺菌處理大致相同。氨基酸態(tài)氮在一定程度上反映了氨基酸的含量。在發(fā)酵前期，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)降解成小分子的氨基酸，在發(fā)酵中后期，小分子的氨基酸發(fā)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，生成各種生香成分。此外，氨基酸態(tài)氮變化趨勢與總生物胺含量的變化趨勢也基本一致，且達(dá)到峰值的時間稍早于生物胺達(dá)到峰值的時間。當(dāng)醬油發(fā)酵體系中含有大量前體氨基酸時，可以產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物就會在適宜條件下將氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的生物胺。因此，發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化與生物胺的含量具有一定相關(guān)性。

圖4 降胺菌對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Changes of AAN levels of high salted diluted state fermentation soy sauces in different strains groups

3.5 對高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中游離氨基酸的影響

表1及表5所示的是發(fā)酵90 d內(nèi)氨基酸含量的變化及營養(yǎng)成分分析。由表1可知隨著發(fā)酵時間的延長，不同種類氨基酸的含量都在逐漸增加，氨基酸總量在不同時期也有明顯的增加，氨基酸總量在發(fā)酵0 d時為14.46 mg/mL，在發(fā)酵10 d時為31 mg/mL，在40 d 時氨基酸總量為45 mg/mL，在90 d時為55 mg/mL。

醬油中必需氨基酸占總氨基酸的比值常用來評判醬油的營養(yǎng)價值[21]。該比例越接近40%，則該醬油的營養(yǎng)價值越高[22]。由表可知，發(fā)酵過程中的醬油營養(yǎng)價值在可接受范圍內(nèi)，沒有因為加入生物胺降解菌而降低醬油的營養(yǎng)價值。

表2是醬油中呈味氨基酸占總氨基酸百分比含量。發(fā)酵醬油的滋味也是評判醬油好壞的標(biāo)準(zhǔn)之一，不同發(fā)酵階段醬油中氨基酸種類及數(shù)量上的差別使它們滋味產(chǎn)生差別[23]。在檢測出的18種氨基酸中，鮮味氨基酸對醬油的品質(zhì)影響最大，由表3可知，鮮味氨基酸在5～10 d增加較快，在40 d后增長變慢，最終含量穩(wěn)定在11%左右。

表1 J2對發(fā)酵醬油中游離氨基酸組成的變化Table 1 Changes of free amino acid composition in fermentation soy sauces with J2 starter

注：Total為氨基酸總量、E為必需氨基酸、N為非必需氨基酸；*代表必需氨基酸。

表2 醬油中呈味氨基酸占總氨基酸百分比含量 單位：%Table 2 The percentage of the taste amino acid in soy sauce

另外，兩種發(fā)酵鮮味的對比中發(fā)現(xiàn)接種J2的醬油鮮味效果優(yōu)于J3。和空白株對比發(fā)現(xiàn)，2株菌的添加對鮮味產(chǎn)生了一定程度的抑制。甜味類氨基酸含量隨著發(fā)酵時間的變化產(chǎn)生了20%左右的變化。芳香族類氨基酸在發(fā)酵過程中沒有出現(xiàn)明顯的變化。但是與空白組對照，兩株菌的芳香族類氨基酸所占比重減小，可見2株菌影響了醬油的芳香風(fēng)味。從風(fēng)味氨基酸的總量來看，未完全發(fā)酵完成的醬油中風(fēng)味物質(zhì)變化不大，至于對最終風(fēng)味的影響，還需進(jìn)一步研究和關(guān)注。

表3是醬油中必需氨基酸的含量與WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式的比較。表格計算了8種必需氨基酸在總氨基酸中的比例，并將數(shù)據(jù)與WHO/FAO規(guī)定的醬油中氨基酸的推薦值比對。通過分析可知：除了Tyr在比重偏低，其他的7種氨基酸均達(dá)到了推薦值，從營養(yǎng)價值，接種生物胺降解菌發(fā)揮了較好的作用。

表3 醬油中必需氨基酸的含量與WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式的比較 單位：%Table 3 The comparison between EAA in soy sauce and the WHO/FAO standard mode

3.6 對醬油發(fā)酵過程中總好氧微生物的影響

醬油發(fā)酵過程中總好氧微生物數(shù)的變化見表4，空白組與實(shí)驗組的微生物數(shù)都是在發(fā)酵初期數(shù)量有所上升，發(fā)酵中后期有所下降的趨勢。在保溫發(fā)酵的前20 d，菌落數(shù)顯著增長(P<0.01)，達(dá)到最大值9.25 lg CFU/mL，可能的原因是：在發(fā)酵的前5 d里，微生物的生長受到鹽濃度的限制，一些不耐鹽的細(xì)菌、酵母菌等死亡，使得初期微生物增長緩慢[24]。在發(fā)酵中期菌落總數(shù)快速上升，可能是因為一些耐鹽菌適應(yīng)環(huán)境并迅速增長。在發(fā)酵的后期微生物數(shù)顯著下降(P<0.01)，可能是因為醬醪的pH、營養(yǎng)物質(zhì)、滲透壓等抑制了微生物的生長繁殖。通過對比空白組與實(shí)驗組可知，2株降解菌在發(fā)酵醬醪中保持著一定存活力和生長能力，這為降胺菌發(fā)揮作用創(chuàng)造了條件[25]。

表4 醬油釀造過程中總好氧微生物總數(shù)的變化Table 4 The change of the total number of bacterial colonies in soy sauce brewing process

4 結(jié)論

從開始發(fā)酵到發(fā)酵結(jié)束pH的變化大小排序是K>J2>J3，其中，W.anomalus、M.farinosa的pH范圍基本符合醬油產(chǎn)品的pH范圍；發(fā)酵過程中食鹽的含量對微生物的生長具有較大的影響，但在實(shí)驗中NaCl濃度發(fā)酵前后沒有顯著差異(P<0.05)；通過游離氨基酸的分析我們可以知道發(fā)酵醬油品質(zhì)的變化，從實(shí)驗中可得，生物胺降解菌的加入對醬油的風(fēng)味并沒有產(chǎn)生較大影響。

2株降胺菌對醬油發(fā)酵過程中的生物胺均具有一定的抑制效果，W.anomalus菌株在組胺、酪胺、亞精胺的降解方面優(yōu)于M.farinosa；對發(fā)酵過程的pH略有影響；對于NaCl濃度和氨基酸含量影響不大；氨基酸態(tài)氮和TVB-N的含量在醬油發(fā)酵過程中呈現(xiàn)上升的趨勢；發(fā)酵過程中微生物數(shù)的統(tǒng)計分析可得：2株菌在發(fā)酵醬醪中均保持著一定存活力和生長能力，這為該菌在工業(yè)生產(chǎn)中的擴(kuò)大應(yīng)用創(chuàng)造了條件。