菊粉外切酶的異源表達、純化及酶學(xué)性質(zhì)

馬俊，安啟坤，唐文竹

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)

菊粉(inulin)是由D-果糖通過β-2,1-糖苷鍵連接而成的鏈狀多聚果糖，且末端以α-1,2-糖苷鍵連接有一個葡萄糖殘基[1]。菊粉作為一種儲備多糖，廣泛存在于植物的根和塊莖中,如菊芋(jerusalemartichoke)、菊苣(chicory)、大麗花(dahlia)和雪蓮果(yacon)等[2]。菊粉外切酶(exo-inulinase，EC 3.2.1.80)能從菊粉的非還原性末端的糖苷鍵開始逐一切下果糖基，因此可以用于水解菊粉生產(chǎn)高果糖漿(high fructose corn syrup， HFCS)[3-4]。高果糖漿具有低分子量、低熱量、高甜度、高滲透壓、高溶解度、沒有晶體形成等優(yōu)勢，在酸奶、冰淇淋、巧克力牛奶等乳制品中被廣泛用作一種重要的甜味劑，同時在制藥企業(yè)也用于制作膠囊配方和注射液等[5]。目前，高果糖漿的制備主要有化學(xué)法、發(fā)酵法和酶法。其中，由于化學(xué)法和發(fā)酵法制備高果糖漿具有產(chǎn)率低，操作復(fù)雜，成本高，副產(chǎn)物多等缺點，酶法制備高果糖漿成為目前食品工業(yè)采用的主要方法[6]。但從野生菌中分離獲得的外切菊粉酶活性較低，且制備工藝復(fù)雜，因此成本居高不下，限制了該酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用。利用基因工程手段可以實現(xiàn)菊粉外切酶的高效表達，從而獲得高活性、高純度的菊粉外切酶，為菊粉外切酶水解菊粉生產(chǎn)高果糖漿奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

類芽孢桿菌(Paenibacillussp. Lfos16)、 pET28-a(+)載體、克隆宿主大腸桿菌DH10B、表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)均由本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DpnI、抗生素(卡那霉素)、IPTG、核酸染料(Goldview II)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR DNA聚合酶等均購自Takara公司。Ni sepharose 6 Fast Flow親和純化填料購自GE公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH 7.0；LLB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 5，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菊粉外切酶基因的克隆及重組菌構(gòu)建

采用Restriction Free Cloning[7-8]的方法，以Paenibacillussp. Lfos16的基因組DNA為模板，通過引物P1:5’-CCGCGCGGCAGCCATATGATGAACGGCGGCAT CG-3’ 和P2: 5’- GATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTACTTCAACCCTCCTTGATGTCT -3’ 對菊粉外切酶基因進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后再將其克隆至pET28-a(+)載體。

將2 μL上述克隆樣品加入到盛有100 μL新鮮制備的E.coliDH10B感受態(tài)細胞的管中，混勻內(nèi)溶物，冰浴5 min。冰浴結(jié)束即刻將混合物轉(zhuǎn)移至冷的電擊杯內(nèi)，輕擊液體以確?；旌衔镂挥陔姄舯撞?，擦干電擊杯外壁的冷凝水和霧氣，將電擊杯放進電擊儀，調(diào)節(jié)電擊轉(zhuǎn)化儀參數(shù)至2.5 kV、25 μF和200 Ω電擊轉(zhuǎn)化。電擊結(jié)束后迅速加入900 μL LB培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移所有液體混合物到無菌的2 mL離心管，37 ℃、200 r/min溫育1 h。將200 μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)至長出適宜大小的單菌落。

挑取單菌落提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒通過XbaI、EcoRV雙酶切驗證及DNA測序，將驗證正確的質(zhì)粒命名為pET28a-Exo-inu，并通過熱擊轉(zhuǎn)入E.coilBL21(DE3)，于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉(zhuǎn)化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

1.2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達及純化

接種菊粉外切酶重組表達菌至100 mL LLB(含30 μg/mL kanamycin)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，于16 ℃、180 r/min誘導(dǎo)18 h；離心收集菌體沉淀，并用ddH2O洗滌菌體2次，離心后用15 mL native binding buffer(pH 7.5)重懸菌體，并進行超聲破碎。10 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。

用native elution buffer(pH 6.5)平衡系統(tǒng)B相，native binding buffer(pH 6.5)平衡A相和Ni2+親和層析柱。加入3 mL粗酶液在室溫下與填料于充分結(jié)合1 h。用native binding buffer(pH 6.5)洗層析柱，收集洗脫峰處樣品，即為穿出液；調(diào)節(jié)B相比例15%，使咪唑終濃度為75 mmol/L，洗滌層析柱，收集洗脫峰處樣品，即為洗雜液。調(diào)節(jié)B相比例100%，使咪唑終濃度為500 mmol /L進行洗脫，收集洗脫峰處樣品，即為洗脫液；

分別取原酶液、穿出液、洗雜液、洗脫液進行SDS-PAGE檢測，確定純化效果。

1.2.3 重組菊粉外切酶轉(zhuǎn)化菊粉產(chǎn)物分析

450 μL 2%的菊粉溶液與50 μL純酶混合，于40 ℃下反應(yīng)10 min，沸水浴5 min終止反應(yīng)。10 000 r/min離心10 min，取上清液，采用TLC法[9]對產(chǎn)物組成進行確定。

1.2.4 酶活測定方法及定義

450 μL 2%的菊粉溶液或蔗糖溶液與50 μL純酶混合，以滅活的酶液與底物同比例混合做為對照，于40 ℃水浴反應(yīng)10 min，沸水浴5 min終止反應(yīng)，用DNS法測還原糖生成量。將以菊粉和蔗糖為底物時測定的酶活分別記為I和S。

酶活定義：上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活單位。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)測定

以下測定中底物均為2%的菊粉溶液。

①最適反應(yīng)溫度：于不同溫度下測定酶活，根據(jù)相對酶活的大小確定最適反應(yīng)溫度；②溫度穩(wěn)定性：將純化后的酶液分別置于不同溫度下溫育2 h后，測定剩余酶活，根據(jù)相對酶活的大小確定溫度穩(wěn)定性；③最適反應(yīng)pH：將純化得到的酶液在不同pH緩沖液中測定酶活，根據(jù)相對酶活的大小確定最適反應(yīng)pH；④pH穩(wěn)定性：將純化后的酶液在不同pH緩沖液中，4 ℃靜置2 h后，測定剩余酶活，根據(jù)相對酶活的大小確定pH穩(wěn)定性；⑤金屬離子對酶活的影響：向酶促反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子使其終濃度為 5 mmol /L，以未處理酶酶活力為對照，計算加入金屬離子后的相對酶活；⑥動力學(xué)常數(shù)測定：不同濃度的菊粉溶液與純化后的酶液等體積混合，于最適條件下反應(yīng)10 min，測定還原糖的生成量。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[10-11]計算出以菊粉為底物時重組外切菊粉酶的動力學(xué)常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉外切酶基因的擴增

以Lfos16的基因組為模板對菊粉外切酶編碼基因進行擴增，預(yù)期片段大小為2 305 bp。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗，其結(jié)果如圖1所示，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致，且條帶單一。

1-exo-inulinase gene；M-DNA Marker圖1 菊粉外切酶基因擴增結(jié)果Fig.1 Amplification products ofexo-inulinase gene

2.2 pET28a-Exo-inu表達載體和工程菌的構(gòu)建

挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)XbaI、EcoRV雙酶切鑒定，預(yù)期得到大小分別為1 234 bp，1 957 bp和4 347 bp的3條片段。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物進行檢驗，結(jié)果如圖2所示， 1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果，大小與預(yù)期結(jié)果一致，將鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，最終確定重組表達質(zhì)粒pET28a-Exo-inu成功構(gòu)建。將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)，于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉(zhuǎn)化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

1-重組質(zhì)粒；M-DNA Marker圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Detection of the recombinant plasmid pET28a-Exo-inu

2.3 重組菊粉外切酶的誘導(dǎo)表達和分離純化

按照1.2.2所述方法對重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu進行誘導(dǎo)表達，超聲破碎獲得粗酶液后，對重組菊粉外切酶進行純化，并收集各組分進行SDS-PAGE檢測，其結(jié)果如圖3所示。

M-Marker；1-粗酶液；2-穿刺液；3-洗雜液；4-洗脫液圖3 重組菊粉外切酶的親和純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinantexo-inulinase after affinity purification

帶有組氨酸標(biāo)簽的重組菊粉外切酶與Ni2+特異性結(jié)合，而不能與Ni2+結(jié)合的蛋白及結(jié)合能力弱的雜蛋白洗脫流出，最終獲得的單一條帶為電泳純的重組酶。SDS-PAGE檢測表明重組菊粉外切酶表觀分子量約為87 kDa，與理論大小一致。

以菊糖為底物，重組菊粉外切酶的純化結(jié)果如表1所示。經(jīng)過Ni2+親和純化，純化倍數(shù)達到3.98倍，回收率為2.80%，比酶活為348.30 U/mg，相比文獻已報道的菊粉外切酶的比酶活高。RAM等[12]從PenicilliumoxalicumBGPUP-4分離純化得到兩種菊粉外切酶，以菊粉為底物的比酶活分別為113.19 U/mg和120.47 U/mg。

表1 重組菊粉外切酶分離純化結(jié)果Table 2 Summary of recombinantexo-inulinase purification

2.4 重組菊粉外切酶轉(zhuǎn)化菊粉產(chǎn)物分析

重組菊粉外切酶與2%菊粉反應(yīng)產(chǎn)物TLC結(jié)果如圖4所示。

1-菊粉；2-菊粉外切酶水解菊粉產(chǎn)物；3-葡萄糖；4-果糖圖4 重組菊粉外切酶菊粉水解產(chǎn)物的TLC分析Fig.4 TLC analysis of products from inulin by recombinant exo-inulinase

可以看出反應(yīng)10 min后底物被完全降解，產(chǎn)生產(chǎn)物果糖(F)及少量葡萄糖(G)，底物轉(zhuǎn)化率為100%。

2.5 重組菊粉外切酶酶活測定

以2%菊粉和2%蔗糖分別為底物測定酶活力，結(jié)果顯示，以菊粉為底物的酶活(I)為259.37 U/mL，以蔗糖為底物的酶活(S)為592.16 U/mL。粗酶液的I/S為0.438，I/S<1，表明該酶為菊粉外切酶[13-14]。

2.6 重組菊粉外切酶酶學(xué)性質(zhì)測定

2.6.1 重組菊粉外切酶的最適溫度與溫度穩(wěn)定性

溫度對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖5所示。

圖5 溫度對重組外切菊粉酶酶活的影響Fig.5 Effects of temperature on activity of recombinant exo-inulinase

重組菊粉外切酶的最適作用溫度為40 ℃；當(dāng)溫度低于40 ℃時，酶活隨溫度的升高而升高；當(dāng)溫度高于40 ℃時，酶活隨溫度的升高而降低，當(dāng)溫度在25～35 ℃時，具有80%以上的相對酶活。

溫度對重組菊粉外切酶穩(wěn)定性的影響如圖6所示。重組菊粉外切酶在溫度低于30 ℃時具有較高的穩(wěn)定性，在低于30 ℃保溫2 h剩余酶活仍高于90%；當(dāng)溫度高于30 ℃時，剩余酶活很快降低，當(dāng)溫度達到35 ℃時，剩余酶活降至15%以下。

圖6 溫度對重組外切菊粉酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of temperature on stability of recombinant exo-inulinase

本研究中重組菊粉外切酶與文獻報道的來源于Paenibacillussp. d9 菌株的菊粉外切酶性質(zhì)比較接近，最適作用溫度均為40 ℃[15]。而與其他菊粉外切酶相比差別較大，來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶最適溫度是55 ℃，且在35～55 ℃靜置24 h后仍剩余80%以上的酶活[16]。來源于Aspergillusniger的菊粉外切酶最適溫度為60 ℃，在低于60 ℃保溫1 h依然有85%酶活性[17]。因此本研究中的重組菊粉外切酶屬于低溫酶，不但在低溫條件下可以高效反應(yīng)，而且在生產(chǎn)工藝中可以通過較低溫度的熱處理使酶失活，節(jié)約能源和費用，這就使得低溫菊粉外切酶在菊粉來源高果糖漿的生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

2.6.2 重組菊粉外切酶的最適pH與pH穩(wěn)定性

pH對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖7所示。重組菊粉外切酶的最適作用pH為6；當(dāng)pH低于6時，酶活隨pH的升高而升高；當(dāng)pH高于6時，酶活隨pH的升高而升降低，且當(dāng)pH達到7時，相對酶活降至40%以下。

圖7 pH對重組菊粉外切酶酶活的影響Fig.7 Effects of pH on activity of recombinant exo-inulinase

不同pH下重組菊粉外切酶的穩(wěn)定性如圖8所示。當(dāng)pH處于6.6～7.6時，重組菊粉外切酶具有較高的穩(wěn)定性，剩余酶活高于90%；當(dāng)pH低于6或高于8時，剩余酶活力降至40%以下。

重組菊粉外切酶的最適作用pH與pH穩(wěn)定性與文獻報道基本一致。如李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的菊粉外切酶于PichiapastorisGS115中進行表達，重組菊粉外切酶的最適pH為4.62。KOBAYASHI等[19]將來源于Microbulbifersp. Strain JAM-3301的菊粉外切酶基因通過大腸桿菌進行表達，其最適pH為6.0，在pH 8～9相對穩(wěn)定。CHEN等[20]將AspergillusficuumJNSP5-06中的菊粉外切酶在大腸桿菌中進行過表達，其最適pH為4.0，并在pH為3.0～4.5時菊粉外切酶穩(wěn)定性較好。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達，其最適pH為4.5，在4 ℃，pH 3.0～6.0環(huán)境中溫育24 h時，能剩余90%酶活。

2.7 金屬離子對菊粉外切酶活性的影響

金屬離子對重組菊粉外切酶的影響如表2所示。其中，Li+對重組菊粉外切酶有一定的激活作用；其余金屬離子均有不同程度的抑制作用，其中Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+對重組菊粉外切酶具有顯著抑制作用，剩余酶活降至10%以下。

各種金屬離子對不同來源的菊粉外切酶的影響差異較大。其中Cu2+能夠完全抑制來源于AspergillusficuumJNSP5-06的菊粉外切酶酶活[20]，而對來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶酶活具有激活作用[21]；Fe2+、Zn2+及Mg2+對來源于PaenibacilluspolymyxaZJ-9的外切型菊粉酶的酶活具有輕微激活作用[22]。

2.8 重外菊粉外切酶動力學(xué)常數(shù)測定

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，測得Km和Vmax的值，結(jié)果如圖9所示。得到的回歸方程為y=108.14x+5.608 1，R2=0.998 8。通過分析計算出以菊粉為底物時Km為19.28 mg/mL，Vmax為0.18 mg/(min·mL)。

圖9 重組菊粉外切酶的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweave-Burk double reciprocal curve of recombinant exo-inulinase

來源不同的菊粉外切酶動力學(xué)常數(shù)差別較大，可能是由于酶活測定方法、底物組成以及計算方法等的差異引起的。其中CHEN等[20]在大腸桿菌中表達AspergillusficuumJNSP5-06中克隆出菊粉外切酶，以菊粉為底物的Km和Vmax分別為(7.1±0.2) mmol/L和(1 000.0±0.1) μmol/(min·mg)。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達，Km為0.322 mmol/L，Vmax為4 317 μmol/(min·mg)。李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的外切菊粉酶于PichiapastorisGS115中進行表達，以菊粉為底物時，Km和Vmax分別為80.53 g/L和4.49 g/(L·min)。

3 結(jié)論

通過RF克隆成功將來源于類芽孢桿菌Paenibacillussp. Lfos16的菊粉外切酶基因重組到pET-28a(+)表達載體上，并在E.coliBL21(DE3)實現(xiàn)了高效表達。通過鎳柱親和層析獲得了電泳純的重組菊粉外切酶。重組菊粉外切酶的表觀分子質(zhì)量為87 kDa，水解菊糖的產(chǎn)物為果糖，且I/S為0.438，確定為外切酶活性。以菊粉為底物，重組菊粉外切酶的比酶活為348.30 U/mg，最適作用溫度和pH分別為40 ℃和pH 6，且當(dāng)溫度低于30 ℃，pH在6.6～7.6時時酶活較穩(wěn)定；Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+具有顯著抑制作用；重組菊粉外切酶對菊粉的Km為19.28 mg/mL，Vmax為0.18 mg/(min·mL)。