叉頭框蛋白A2 對肝癌細胞增殖和成瘤的抑制作用

王立斌 王曦 曹佳 王丹妮 馮惠敏 李曉菡 劉世海

寧夏醫(yī)科大學1總醫(yī)院生物芯片國家工程中心寧夏分中心，2臨床醫(yī)學院（銀川750004）；3山東臨沂市中醫(yī)醫(yī)院（山東臨沂276000）；4青島大學附屬醫(yī)院（山東青島266003）

肝癌是我國常見高發(fā)腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高，每年死于肝癌的患者人數(shù)約占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌最常見類型，約占85%～95%［1-2］。研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，篩選新的治療方法及靶點，是目前肝癌研究的一個主要方向。

叉頭框蛋白A2（forkhead box A2，F(xiàn)OXA2）也被稱為肝細胞核因子3-β（hepatocyte nuclear factor-3beta，HNF3-β），是肝特異性白蛋白和轉甲狀腺素蛋白的轉錄激活因子，可以與染色質相互作用，調控基因轉錄和翻譯，參與機體生長發(fā)育［3］。同時，F(xiàn)OXA2 也是肝臟發(fā)生的先驅因子，具有調節(jié)肝臟發(fā)育和代謝平衡的作用［4-5］。近年來，有多篇文獻報道FOXA2 在多種癌癥中具有抑癌作用，SMITH 等［6］發(fā)現(xiàn)在內膜樣子宮內膜癌組織中FOXA2 具有抑制癌細胞增殖的特點；VORVIS 等［7］利 用CRISPR∕Cas9 技 術 敲 除FOXA2 基 因，證 實FOXA2 基因具有抑制前列腺腫瘤細胞生長的作用；MCDANIEL 等［8］發(fā)現(xiàn)在膽汁淤積性肝癌發(fā)生過程中，F(xiàn)OXA2 具有調節(jié)肝星狀細胞增殖轉化，并對膽道定向祖細胞的發(fā)生和分化具有調控作用。DING 等［9］在膠質瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA2 在膠質瘤細胞系中表達顯著下調，過表達FOXA2 可抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，同時在裸鼠移植瘤中過表達FOXA2 可抑制神經(jīng)膠質瘤的生長，提示FOXA2 可能成為膠質瘤的潛在治療靶點。這些研究結果提示了FOXA2 的抑癌作用，并可能作為癌癥治療的潛在靶點。

本研究首先檢測FOXA2 在HCC 組織和細胞系中的表達，并驗證FOXA2 對HepG2 細胞體外克隆能力以及體內裸鼠成瘤性的影響，旨在探討FOXA2 對HCC 發(fā)生發(fā)展的影響，為進一步深入研究FOXA2 對肝癌發(fā)生的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 臨床組織樣本來自2016年1-12月青島大學附屬醫(yī)院肝膽外科手術切除的HCC癌組織以及相應癌旁組織（＞5 cm 處），經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準且獲得患者知情同意。共收集標本45 例，其中男27 例，女18 例，年齡為32～69 歲，中位年齡52 歲。

1.1.2 細胞與試劑 人HCC 細胞HepG2、SMMC-7721、SK-Hep1 及人胚腎上皮細胞293T（中科院上海細胞庫，中國）；DMEM∕High Glucose（HyClone，USA）；胎牛血清（Excell，上海）；免疫組化試劑盒（康為世紀，北京）；FOXA2 抗體（鼠單克隆抗體，ab117542，Abcam，上海）；GAPDH 抗體（鼠單克隆抗體，2D4A7，Novus Biologicals，USA）；二抗（HRP標記羊抗鼠抗體#7076，CST，USA）；TRIzol（Invitrogen，USA）；FOXA2、GAPDH引物序列見表1（上海捷瑞生物公司，上海）；反轉錄試劑盒（TaKara，大連）；BALB∕c 裸鼠（北京維通利華生物有限公司，北京）；FOXA2過表達、陰性對照慢病毒（吉凱基因，上海）。

表1 FOXA2、GAPDH 引物序列Tab.1 Primers sequences of FOXA2 and GAPDH

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色（IHC） 將石蠟包埋的組織切片用二甲苯脫蠟復水，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，高溫高壓抗原修復，PBS 洗3 次，每次5 min，正常的山羊血清封閉1 h 后孵育一抗FOXA2（1∶1 000），4 ℃過夜。PBS 洗3 次，隨后在室溫下用生物素化二抗處理1 h。PBS 洗滌，鏈霉素室溫孵育，PBS 洗滌后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。蒸餾水沖洗，蘇木精復染，脫水，中性樹脂封片（PBS 代替一抗，作為陰性對照）。隨機選取10 個高倍視野（× 400），以陽性細胞所占的百分比聯(lián)合細胞的染色強度進行評分，評分標準：陽性細胞數(shù)≤5%時記為0 分；陽性細胞數(shù)在6%～25%時，記為1 分；陽性細胞數(shù)在26%～50%時，記為2 分；陽性細胞數(shù)在51%～75%時，記為3分；陽性細胞數(shù)＞75%時，記為4 分。各組評分乘積≥2 時，即判定FOXA2 蛋白為陽性［10］。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與選擇 自液氮取出凍存細胞后常規(guī)復蘇，使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃無菌培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.3 慢病毒感染細胞 細胞感染時，取對數(shù)生長期細胞消化后接種至孔板中，待細胞融合度達到40%～50%時，以MOI＝10 與新鮮培養(yǎng)基混勻后常規(guī)培養(yǎng)。感染24 h 后用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 Real-time PCR 組織液氮研磨后使用Trizol 試劑進行裂解，細胞直接使用Trizol 試劑裂解，進行總RNA 抽提，并反轉錄成為cDNA 后使用SYBR 熒光染料進行Real-time PCR 反應，檢測FOXA2 mRNA 的表達情況。PCR 反應體系為：cDNA 0.5 μL，SYBR 10 μL，上、下游引物（1 μmol∕L）各1 μL，ddH2O 補足至總體積20 μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。每個反應設置3 個復孔，內參以GAPDH為標準，結果計算采用2-ΔΔCT進行分析，實驗結果重復3 次。

1.2.5 Western Blot 以感染慢病毒載體后的各組細胞為材料，提取總蛋白，蛋白上樣量為20 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳后經(jīng)半干轉（12 V，60 min）至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；PBST 洗滌后加入加HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，PBST 洗滌后用增強化學發(fā)光（ECL）曝光、顯影。內參選擇GAPDH 為標準，電泳條帶用全自動凝膠成像分析儀進行灰度分析。實驗結果重復3 次。

1.2.6 平板克隆形成實驗 選擇對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化，細胞計數(shù)后，以1 × 103∕孔接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁后再進行病毒轉染。實驗分為FOXA2 組、NC 組以及Mock組。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d 根據(jù)細胞生長狀況進行換液，培養(yǎng)至10 d 后終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基后PBS 沖洗2 遍，甲醇固定15 min，結晶紫染色15 min。觀察并計數(shù)各組的細胞克隆數(shù)，每組設3個復孔。實驗重復3 次。

1.2.7 裸鼠成瘤 體質量為18～22 g 的4～6 周齡BALB∕c 裸鼠15 只，隨機分為3 組，每組5 只。病毒感染HepG2 細胞后4 d，胰酶消化各組細胞，并使用無胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基調整細胞終濃度為1 × 108∕mL。取0.1 mL 細胞懸液接種于裸鼠右后肢背側皮下（1 × 107∕只），建立裸鼠皮下移植瘤模型。20 d 后處死裸鼠，完整剝離皮下腫瘤，稱量移植瘤重量，并計算瘤重抑瘤率。瘤重抑瘤率=（1-實驗組瘤重∕對照組瘤重）× 100%。將瘤組織送病理科進行HE 染色。

1.3 統(tǒng)計學方法 以SPSS 17.0 分析軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，t檢驗及單因素方差分析樣品間差異，以P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學意義。計數(shù)資料均進行3 次重復實驗。

2 結果

2.1 免疫組化法檢測FOXA2 在肝細胞癌組織及癌旁組織中的表達 對HCC 組織和對應癌旁組織的石蠟切片進行FOXA2 蛋白的免疫組織化學染色，F(xiàn)OXA2 陽性染色呈黃色或棕黃色，主要定位于細胞核中。FOXA2 蛋白在HCC 組織和配對癌旁組織陽性率分別為40.0%（14∕35）和74.3%（26∕35），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2= 7.756，P＜0.01），見圖1。

圖1 FOXA2 在肝細胞癌組織及癌旁組織中的表達（SP法，×400）Fig.1 The expression of FOXA2 in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues（SP method，×400）

2.2 Real-time PCR 法 檢 測FOXA2 mRNA 在 肝細胞癌組織和細胞系中的表達 分別提取組織樣本及HCC 細胞系總RNA，進行Real-time PCR 反應，檢測FOXA2 在組織及細胞中的表達情況。結果顯示，F(xiàn)OXA2 在癌旁組織和癌組織中的相對表達量分別為：（1.000 ± 0.000 1）、（0.456 ± 0.066），數(shù)據(jù)結果表明FOXA2 在癌組織中表達顯著低于癌旁組織（P＜0.000 1），見圖2A；FOXA2 在對照細胞293T 和HCC 細胞HepG2、SK-Hep1、SMMC-7721 的表達分別為：（1.000 ± 0.000 1）、（0.057 ± 0.026）、（0.047±0.009）、（0.013±0.003），結果表明FOXA2在3 種HCC 細胞中的表達均低于人胚腎上皮細胞293T（P＜0.000 1），見圖2B。

2.3 病毒感染HepG2 細胞后FOXA2 的表達 感染FOXA2 過表達慢病毒，Real-time PCR 檢測HepG2細胞中FOXA2 mRNA的表達，Western Blot檢測HepG2 細胞中FOXA2 蛋白的表達情況。Mock組、NC 組和FOXA2 組的mRNA 表達量分別為：（1.000 ± 0.000 1）、（1.100 ± 0.068）、（736.500 ±19.400）；蛋白表達量分別 為：（0.378 ± 0.029）、（0.333 ± 0.026）、（1.139 ± 0.052）。數(shù)據(jù)結果表明，與Mock組及NC組相比，F(xiàn)OXA2組中FOXA2 mRNA和蛋白的表達均明顯增高（均P＜0.01），見圖3、4。

2.4 過表達FOXA2 對HepG2 細胞體外增殖能力的影響 平板克隆形成實驗中Mock 組、NC 組和FOXA組的細胞克隆數(shù)分別為：（155.330 ± 2.906）個、（141.000 ± 3.786）個、（93.000 ± 2.309）個。數(shù)據(jù)結果表明，過表達FOXA2 后，HepG2 細胞所形成的集落數(shù)較NC 組和Mock 組均顯著降低），提示過表達FOXA2 抑制HepG2 細胞體外增殖（均P＜0.05），見圖5。

圖2 FOXA2 mRNA 在肝細胞癌組織和細胞系中的表達Fig.2 The expression of FOXA2 mRNA in hepatocellular carcinoma tissues and cell lines

圖3 感染FOXA2FOXA2 過表達慢病毒后檢測FOXA2FOXA2 mRNA 的表達Fig.3 The expression of FOXA2 mRNA after infection with FOXA2 overexpressing lentivirus

圖4 感染FOXA2 過表達慢病毒后檢測FOXA2 蛋白表達Fig.4 The expression of FOXA2 protein after infection with FOXA2 overexpressing lentivirus

圖5 過表達FOXA2 對HepG2 細胞體外增殖能力的影響Fig.5 The effect of overexpression of FOXA2 on the proliferation of HepG2 cells

2.5 過表達FOXA2 對體內裸鼠成瘤的影響 感染FOXA2 慢病毒載體，將HepG2 細胞接種于裸鼠右后肢背側皮下，1 周后所有裸鼠皮下均可見明顯腫塊。20 d 后處死裸鼠后瘤體重量統(tǒng)計結果表明，過表達FOXA2 顯著抑制HepG2 細胞移植瘤重量的增加，抑瘤率增高，與Mock 組和NC 組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖6、表2。

圖6 過表達FOXA2 對體內裸鼠成瘤能力的影響Fig.6 The effect of overexpression of FOXA2 on tumorigenic ability in nude mice

表2 不同組別移植瘤重量和抑瘤率Tab.2 Tumor weight and inhibition rate in different groups±s

表2 不同組別移植瘤重量和抑瘤率Tab.2 Tumor weight and inhibition rate in different groups±s

注：NC 組與Mock 組比較，P＞0.05；FOXA2 組與Mock 組、NC 組比較，均P＜0.01

組別Mock 組NC 組FOXA2 組裸鼠移植瘤數(shù)5 5 5平均瘤重（mg）200.00±17.03 194.00±27.31 80.00±9.49抑瘤率（%）- 3 60

2.6 過表達FOXA2 對移植瘤組織形態(tài)結構的影響 將分離后的移植瘤組織進行固定、切片，通過HE 染色觀察瘤體細胞形態(tài)與結構的特點。染色結果顯示，Mock 組和NC 組瘤體中細胞排列疏松且雜亂無章，瘤內血管豐富；而FOXA2 過表達后瘤體中細胞排列密集，相對有序，瘤內血管少見（圖7）。

圖7 過表達FOXA2 對移植瘤組織形態(tài)結構的影響Fig.7 The effect of overexpression of FOXA2 on the morphology and morphology of transplanted tumors

3 討論

HCC 是一種肝臟惡性腫瘤，大約60%～80%的患者被確診時已是癌癥晚期，失去了手術治療的機會，只有5%的HCC 患者可存活5年以上［11］。探究HCC 發(fā)展的分子調控機制，篩選HCC 早期診斷靶點，提高HCC 診療水平，是改善預后，延長患者生存期的關鍵。

FOXA2 基因位于人20 號染色體短臂，長度為2 242 bp，在編碼叉頭框家族的多數(shù)DNA 結合蛋白結構中，其氨基酸氨基末端和羧基末端都存在大約100 個氨基酸長度的保守序列，這些保守序列的氨基末端和羧基末端在不同組織中分別發(fā)揮基因轉錄調控作用［12］。作為一種轉錄因子，F(xiàn)OXA2在細胞成熟和分化過程中起主要調控作用，同時，其對細胞周期轉換、個體發(fā)育以及能量代謝的動態(tài)平衡等均有調控作用［13-14］。FOXA2 在胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中均表達下調，F(xiàn)OXA2 的過表達可抑制前列腺癌遷移以及肺癌和乳腺癌的上皮-間質轉化，而敲低FOXA2 則表現(xiàn)出相反的結果，說明FOXA2 在這些腫瘤中具有抑癌基因的作用［15-16］。WANG 等［17］通過比較36 例HCC 癌組織及其對應癌旁組織中FOXA2 表達，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，F(xiàn)OXA2 在癌組織中的表達明顯降低，F(xiàn)OXA2 可抑制MMP-9 的轉錄和表達，進而抑制HCC 的侵襲性和EMT 轉移，提出FOXA2 可能成為治療HCC 的新靶點。

本研究通過檢測45 例HCC 臨床組織樣本中FOXA2 mRNA 和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)FOXA2 在肝細胞癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，且3 種HCC細胞系中的表達顯著低于正常細胞，證實FOXA2具有抑癌基因的作用。為進一步研究FOXA2 對HCC 細胞增殖能力和腫瘤生長的影響，選擇HepG2 細胞進行后續(xù)研究，通過構建FOXA2 過表達載體并轉染HepG2 細胞，Real-time PCR 及Western Blot 實驗均證實穩(wěn)定過表達FOXA2 細胞系構建成功?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，過表達FOXA2后HepG2 細胞的克隆數(shù)顯著少于Mock 組和NC組，說明FOXA2 具有抑制肝癌細胞增殖的作用，這與文獻報道［18］一致。同時，將感染FOXA2 過表達病毒的HepG2 細胞接種于裸鼠右后肢背側皮下，構建裸鼠異體移植瘤模型，檢測FOXA2 對裸鼠腫瘤體內生長的影響。結果表明，過表達FOXA2 對HepG2 細胞的致瘤性具有顯著的抑制作用，與Mock 組和NC 組比較，過表達FOXA2 移植瘤重量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義，說明FOXA2具有顯著抑制移植瘤生長的作用。以上結果進一步證實了FOXA2 對HCC 體外增殖及體內腫瘤生長的抑制作用。

本研究驗證了FOXA2 在HCC 中表達下調，說明FOXA2 在HCC 發(fā)生發(fā)展中具有抑癌作用，但FOXA2 抑癌的分子機制尚不明確，課題組后續(xù)將繼續(xù)開展有關FOXA2 在HCC 發(fā)生過程中的分子調控機制的研究，為肝細胞癌早期診斷和治療靶點的選擇提供理論支持。