油茶籽美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物抗氧化性

楊 楠 羅 凡 費(fèi)學(xué)謙 鐘海雁

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院1，長(zhǎng)沙 410004)(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所2，杭州 311400)

美拉德反應(yīng)是指氨基化合物和羰基化合物之間發(fā)生的非酶促褐變反應(yīng)[1]。美拉德反應(yīng)進(jìn)程包括初始、中間和最終階段等三個(gè)階段，而且美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard Reaction Products，MRPs)種類繁多。MRPs包括還原酮，雜環(huán)化合物，類黑精等，其中某些物質(zhì)具有顯著的抗氧化性[2-3]。MRPs不僅對(duì)食品的色澤、風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，還具有抗誘變作用[4]、抗腫瘤作用[5]、抗增殖作用[6]、降血壓作用[7]等生物活性，對(duì)于防治疾病，提高人類身體健康方面有重要意義。

Durmaz等[8]研究了焙烤對(duì)杏仁油氧化穩(wěn)定性和抗氧化能力的影響，結(jié)果表明：180 ℃下，隨著焙烤時(shí)間增加，杏仁油氧化穩(wěn)定性和抗氧化能力呈增強(qiáng)趨勢(shì)，得出可以通過(guò)適當(dāng)?shù)暮婵緛?lái)改善油性堅(jiān)果和種子的保質(zhì)期，進(jìn)一步研究MRPs可以保護(hù)分子結(jié)構(gòu)防止油氧化變質(zhì)。陳海光等[9]研究了模式美拉德體系產(chǎn)物對(duì)油脂抗氧化性能的影響，結(jié)果表明：3%半胱氨酸,1%葡萄糖，以及0.5%鹽酸硫胺素混合于100 g的甘油中，調(diào)pH值8，在110 ℃下反應(yīng)1.5 h，制得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物向油脂中添加1%，測(cè)得油脂的抗氧化性最好。Severini等[10]研究了榛子美拉德產(chǎn)物在烘烤和貯藏過(guò)程中脂質(zhì)氧化的相互作用，實(shí)驗(yàn)證明：150 ℃下的榛果油中MRPs可以減少榛果油的脂質(zhì)氧化。

油茶籽在生產(chǎn)和壓榨過(guò)程中可能會(huì)經(jīng)過(guò)剝殼、破碎、蒸炒[11]等高溫工藝，具有產(chǎn)生美拉德反應(yīng)的溫度條件。本研究針對(duì)油茶籽中美拉德反應(yīng)發(fā)生的溫度條件，美拉德反應(yīng)發(fā)生的指標(biāo)及其產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行探索，以期摸清油茶籽在加工過(guò)程中物化特性的變化規(guī)律，為優(yōu)化油茶籽加工工藝以及油茶籽油營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮成熟的油茶籽經(jīng)干燥后分別經(jīng)過(guò)30、60、90、120、150 ℃烘箱加熱處理0、20、40、60 min后分別得到液壓壓榨油冷藏備用與脫脂油茶籽粉：處理后的油茶籽經(jīng)粉碎、浸提、干燥后冷藏備用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(96%)；2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(98%)；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2550紫外分光光度計(jì)；DGG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；XW-80A渦旋混合儀；Avanti J-E離心機(jī)；MTN-2800D氮吹儀；CM-3600A分光測(cè)色計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物提取

稱取5 g的脫脂油茶籽粉，加入乙酸乙酯50 mL，置于高速均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)提取5 min后，在置于高速離心機(jī)10 000 g、4 ℃離心10 min。取上清液，氮?dú)獯蹈?，并用甲醇定容?0 mL，冷藏備用[12]。

1.3.2 美拉德反應(yīng)底物和水分的測(cè)定

還原糖和水分測(cè)定分別參考國(guó)標(biāo)NYT 1278—2007/IVS 67.080.20[13]和GB 5009.3—2016[14]。

游離氨基酸的測(cè)定參照Benjakdl等[15]的方法并稍作修改。取125 μL反應(yīng)液與2.0 mL 0.212 5磷酸鹽緩沖液(pH8.2)混合，加入0.01%TNBS溶液1.0 mL，充分混合后，在50 ℃水浴中避光反應(yīng)30 min。加入2.0 mL 0.1 mol/L Na2SO3終止反應(yīng)，冷卻15 min，于波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.3 美拉德反應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定

褐度的測(cè)定：取1 g脫脂油茶籽粉，加入20 mL50%乙醇，在高速均質(zhì)機(jī)作用下，冰浴中提取10 min。提取液于4 ℃、10 000 g條件下離心10 min，過(guò)濾脫脂，收集濾液。分別在294 nm處測(cè)定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸光度和420 nm處測(cè)定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值[16]。

色值的測(cè)定：采用投射模式光路長(zhǎng)度為10 mm，測(cè)量面尺寸為55 nm×57 mm的光學(xué)清潔玻璃制成的比色皿[17]。在儀器校正時(shí)，以去離子水作為校正標(biāo)尺。校正完畢后，約20 mL壓榨油倒入比色皿中，進(jìn)行測(cè)定。

pH測(cè)定：稱取0.5 g脫脂油茶籽粉與10 mL蒸餾水混合并劇烈振蕩10 min后5 000 g離心3 min，棄去沉淀，用pH計(jì)測(cè)定上清液的pH值[18]。

1.3.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性

DPPH法：取1 mL反應(yīng)液，加入0.2 mmol/LDPPH甲醇溶液3 mL。室溫條件避光反應(yīng)30 min，以甲醇做參比，517 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值。DPPH自由基清除活性按公式計(jì)算[19]：

自由基清除活性=A0(A1-A2)/A0×100%

式中：A0為未加MRPS時(shí)DPPH溶液的吸光度；A1為MRPS反應(yīng)一定時(shí)間后DPPH溶液的吸光度；A2為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。

ABTS測(cè)定：取1 mL反應(yīng)液，加入ABTS工作液3 mL充分混勻。避光反應(yīng)30 min，以甲醇做參比，734 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值，ABTS自由基清除活性按公式計(jì)算：

自由基清除活性=(A空白-A樣品)/A空白×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 美拉德反應(yīng)前體物

2.1.1 還原糖含量的分析

還原糖作為美拉德反應(yīng)的初始物，其含量測(cè)定結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)只有在30 ℃時(shí)還原糖含量是增加的，在60、90、120、150 ℃時(shí)隨著加熱時(shí)間的增加，還原糖含量是減少的。可能在60、90、120、150 ℃有美拉德反應(yīng)發(fā)生消耗了還原糖至其含量減少。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫的條件下隨著儲(chǔ)藏的時(shí)間延長(zhǎng)還原糖的含量是增加的[20]。這可能是油茶籽在未經(jīng)過(guò)熱處理時(shí)還原糖含量增加的原因。

圖1 美拉德產(chǎn)物還原糖含量的變化

2.1.2 游離氨基酸的分析

游離氨基酸是美拉德反應(yīng)另一初始物，反應(yīng)前后油茶籽中游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

圖2 美拉德產(chǎn)物游離脂肪酸含量的變化

游離氨基酸含量的變化反應(yīng)美拉德進(jìn)行程度，游離氨基酸減少的程度越大，反應(yīng)進(jìn)行越深[21]。從圖2可以看出，在相同的加熱溫度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，游離氨基酸酸含量是先降低后趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)的進(jìn)行有高分子質(zhì)量的產(chǎn)物生成，從而使游離氨基酸含量逐漸降低。另外，隨著反應(yīng)溫度的提高游離氨基酸含量降低幅度增大，說(shuō)明溫度的提高有利于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成。這與Naranjo等[22]對(duì)酪蛋白與還原糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)研究的規(guī)律相似。

2.2 美拉德反應(yīng)指標(biāo)

2.2.1 水分的分析

含水分也是研究美拉德反應(yīng)進(jìn)程的一個(gè)指標(biāo)，油茶籽加熱前后水分變化如圖3所示。

圖3 美拉德產(chǎn)物水分的變化

從圖3可以看出，看出在相同的加熱溫度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水分是先降低后趨于平穩(wěn)。在30 ℃時(shí)下降不明顯，而在120、150 ℃加熱40～60 min時(shí)下降最多，水分分別降低了0.062、0.09 g/100 g。油茶籽經(jīng)過(guò)加熱處理后其水分含量降低，可能會(huì)提高茶油的抗氧化性[23]。

2.2.2 褐度的變化

蛋白質(zhì)與糖反應(yīng)往往伴隨著褐變現(xiàn)象，這一類物質(zhì)統(tǒng)稱類黑素。本研究通過(guò)測(cè)定294、420 nm吸光度來(lái)反映褐變程度與類黑素的生成量，以及美拉德不同階段的反應(yīng)程度。其中294 nm的吸光度值用于表征中間美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(圖4)，420 nm的吸光度值用于表征末期美拉德反應(yīng)產(chǎn)物-類黑精[24-25 ](圖5)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)加熱處理后油茶籽的吸光度明顯增加，其中較為明顯的是120 ℃和150 ℃。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值增加，溶液顏色逐漸加深，表明形成了褐色的聚合體-類黑精。類黑精是美拉德反應(yīng)中主要抗氧化成分。由于類黑精是一種以短肽和色素相結(jié)合的混合體，美拉德反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，有利于色素物質(zhì)產(chǎn)生，從而加深了反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度。隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物的抗氧化能力也顯著增強(qiáng)[26]。這可能是因?yàn)樵陬惡诰旌象w中，其短肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)具有抗氧化肽的特征，因而具有抗氧化活性。

圖4 美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的變化

圖5 美拉德反應(yīng)最終產(chǎn)物的變化

2.2.3 色值的分析

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物并非單一物質(zhì)，而是十分復(fù)雜的物質(zhì)體系，既有一些低分子量的化合物，也有一些例如類黑素等高分子質(zhì)量的物質(zhì)。所以單一的波長(zhǎng)并不能完全反映美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的真實(shí)顏色。本研究通過(guò)色差計(jì)測(cè)定反應(yīng)體系的顏色變化(表1)，以期能全面反映美拉德反應(yīng)不階段產(chǎn)物的色澤指標(biāo)。

從表6可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)L*值、b*值先增大后減少，a*值先減小后增大。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，油茶籽油顏色逐漸加深，在30、60、90 ℃時(shí)40 min之前變化的不是特別明顯，90 ℃在40 min后顏色急劇加深尤其是在150 ℃加熱后顏色比較深。結(jié)果表明加熱溫度會(huì)導(dǎo)致油茶籽油顏色的變化，溫度越高顏色越深；加熱時(shí)間也會(huì)影響油脂顏色變化，但沒(méi)有溫度影響明顯。

表1 美拉德產(chǎn)物色值的變化

2.2.4 pH值的分析

油茶籽加熱前后pH變化如圖6所示。

圖6 美拉德產(chǎn)物pH值變化

從圖6中得知油茶籽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH值小于7,且隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值先升高后降低，隨溫度的升高pH值增大，在20 min時(shí)pH值最大?？赡苁前被岬膲A性基團(tuán)-氨基在加熱過(guò)程中不斷與還原糖羧基縮合，使得游離的氨基酸被封閉，致使體系的pH值不斷下降。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性分析

DPPH·可以用于反映物質(zhì)的抗氧化性。本研究測(cè)定加熱前后油茶籽中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物清除DPPH·自由基的能力(圖7)。

由圖7可知，不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間提取的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物都具有一定的清除DPPH·作用，并且清除自由基能力隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。120、150 ℃下的美拉德產(chǎn)物的自由基清除能力呈相同的趨勢(shì)，40～60 min時(shí)自由基清除率顯著增加，在反應(yīng)60 min時(shí)達(dá)到最高分別是43.06%和48.87%。

圖7 美拉德產(chǎn)物清除DPPH·能力變化

ABTS·也可以反映物質(zhì)的抗氧化性。本研究測(cè)定了加熱前后油茶籽中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物清除ABTS+·自由基的能力(圖8)。不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間提取的美拉德產(chǎn)物都具有清除ABTS+·的作用，并且清除自由基能力隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。150 ℃下的美拉德產(chǎn)物的自由基清除能力最強(qiáng)，在反應(yīng)60 min時(shí)達(dá)到最高為89.9%。

圖8 美拉德產(chǎn)物清除ABTS+·能力變化

3 結(jié)論

本研究測(cè)定不同加熱溫度時(shí)間處理油茶籽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果表明其還原糖含量、游離脂肪酸含量、含水量、pH值隨著時(shí)間的增加而減少；而顏色隨著加熱時(shí)間增加而加深，在120、150 ℃美拉德產(chǎn)物最多；美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)ABTS+·、DPPH·自由基清除作用隨著反應(yīng)時(shí)間增加而增加。