水稻膜聯(lián)蛋白基因OsAnn8干旱和低溫條件下表達(dá)模式以及CRISPR/Cas9定點(diǎn)編輯

卻志群，於紫蕾，沈春修

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院,江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000)

環(huán)境中的各種非生物脅迫會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量，由于全球異常氣候頻現(xiàn)和不適當(dāng)?shù)霓r(nóng)業(yè)經(jīng)營(yíng)管理方法，非生物脅迫已經(jīng)成為威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的一大挑戰(zhàn)。非生物脅迫對(duì)植物的傷害主要是通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)的平衡失調(diào)和細(xì)胞死亡的方式造成[1]。為了維持細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制的穩(wěn)定性，植物進(jìn)化出一組相關(guān)基因，這些基因的表達(dá)可以幫助植物適應(yīng)逆境環(huán)境，從而使植物可以在逆境條件下生存下來(lái)[2]。干旱和低溫脅迫是植物在生命周期中經(jīng)常會(huì)遇到的脅迫壓力。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與干旱和低溫脅迫防御機(jī)制相關(guān)的基因，膜聯(lián)蛋白就是其中的一類，膜聯(lián)蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，最近，還有報(bào)道在原核生物里也發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白的存在，膜聯(lián)蛋白是一個(gè)超級(jí)基因家族，植物膜聯(lián)蛋白屬于家族D，其下面又被進(jìn)一步分化成幾個(gè)亞基因家族[3-4]，在進(jìn)化過(guò)程中，植物膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都變得越來(lái)越多樣化[3]。已經(jīng)有報(bào)道，無(wú)論是在正常生長(zhǎng)條件還是在脅迫環(huán)境條件下，膜聯(lián)蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用[3, 5-7]。在擬南芥中首先鑒定到了第一個(gè)多基因膜聯(lián)蛋白家族，該家族有8個(gè)基因組成[3, 5, 8-14]，表達(dá)和功能分析證實(shí)它們是一個(gè)多功能的蛋白質(zhì)家族。它們具有Ca2+結(jié)合、離子通道和過(guò)氧化物酶活性等不同的生物學(xué)功能，這些功能都是與植物生長(zhǎng)發(fā)育和植物在脅迫條件下的反應(yīng)緊密相關(guān)的[15]。已有報(bào)道在不同的脅迫條件下，植物膜聯(lián)蛋白的表達(dá)量會(huì)增強(qiáng)且會(huì)大量聚集在細(xì)胞膜上[16-19]。膜聯(lián)蛋白在細(xì)胞膜上的大量聚集可能與離子通道結(jié)構(gòu)搭建，膜的保護(hù)以及ROS誘導(dǎo)信號(hào)等諸多功能相關(guān)。

雖然關(guān)于植物膜聯(lián)蛋白的研究已有不少報(bào)道，然而，有關(guān)水稻膜聯(lián)蛋白在非生物脅迫條件下的作用和相關(guān)機(jī)制的研究目前仍處于初級(jí)階段。Jami等[20]利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的水稻基因組序列，通過(guò)與擬南芥中的膜聯(lián)蛋白基因進(jìn)行同源序列比對(duì)，首次在水稻中鑒定發(fā)現(xiàn)10個(gè)膜聯(lián)蛋白基因家族成員。隨后，Qiao 等[18]通過(guò)RNAi和過(guò)表達(dá)的分析證實(shí),水稻膜聯(lián)蛋白OsAnn1通過(guò)調(diào)控抗氧化物質(zhì)的積累增強(qiáng)了水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性。Shen等[21]通過(guò)CRISPR/CAS9介導(dǎo)基因編輯技術(shù)定點(diǎn)敲除了水稻OsAnn3位點(diǎn)，并進(jìn)一步證實(shí)了T1敲除突變體植株的耐寒性相比耐冷野生型對(duì)照明顯減弱，說(shuō)明水稻膜聯(lián)蛋白OsAnn3參與了水稻低溫脅迫條件下的耐冷性反應(yīng)。

本研究以三-四葉期的耐冷粳稻TP309作為試驗(yàn)材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)技術(shù)對(duì)水稻膜聯(lián)蛋白基因家族成員之一的OsAnn8(LOC_Os09g20330)在低溫脅迫條件下和干旱處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，而后通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)對(duì)水稻膜聯(lián)蛋白基因OsAnn8的外顯子進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并成功地獲得了靶位點(diǎn)敲除的T0轉(zhuǎn)基因突變體植株。該研究為后續(xù)OsAnn8基因在干旱和低溫脅迫環(huán)境下的功能和作用機(jī)制研究奠定了重要的材料基礎(chǔ)。也證實(shí)了CRISPR/CAS9技術(shù)在水稻功能基因研究中應(yīng)用的高效和易操作的特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料與處理 以水稻粳稻品種TP309作為轉(zhuǎn)基因受體和非生物脅迫處理試驗(yàn)材料。在江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中用無(wú)菌水及濾紙發(fā)芽，然后移栽到規(guī)格19.5 cm×14.5 cm×5.5 cm(長(zhǎng)× 寬× 高)的盛有稻田泥土的塑料盒中，每盒種植3棵，種植于平均溫度約35 ℃的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，待正常生長(zhǎng)至三-四葉期，選擇水稻苗長(zhǎng)勢(shì)一致的2個(gè)盆分別用于干旱和低溫處理，其中一盆處理樣品停止灌溉直到泥土表面看不到水，開(kāi)始進(jìn)行土壤干旱脅迫處理，處理后72 h(3 d)和96 h(4 d)對(duì)水稻苗葉片進(jìn)行取樣；將另一盆于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行24 h(1 d)、48 h(2 d)和72 h(3 d)的低溫處理。

1.1.2 載體與轉(zhuǎn)化菌株 本研究中，使用到的載體包括T載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，基因編輯克隆載體psgR-Cas9-Os和植物表達(dá)載體pSK51[21-22]，使用到的菌株有大腸桿菌菌株Trans5α和農(nóng)桿菌菌株EHA105。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻材料RNA 提取 將TP309水稻幼苗在實(shí)驗(yàn)室中常溫條件下培養(yǎng)至三-四葉期，分別取處理前和各階段處理的水稻葉片于液氮中研磨成粉，總RNA的提取按OMEGA公司E.Z.N.A? Total RNA KitⅡ試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和cDNA第一鏈合成 參考Rice Genome Annotation Project Database (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml) 中公布的LOC_Os09g20330位點(diǎn)的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量擴(kuò)增引物OsAnn8-F和OsAnn8-R (表1)。引物序列由上海生工生物有限公司合成，使用試劑盒中的Oligo dT 作為反轉(zhuǎn)錄的3′端引物，然后根據(jù)TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α-(code no.FSK-100) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)之前，先進(jìn)行退火溫度的梯度PCR擴(kuò)增摸索調(diào)整引物擴(kuò)增的特異性，選擇擴(kuò)增特異性好的退火溫度在StepOnePlusTM熒光定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)計(jì)算ΔΔCt值的方法評(píng)估基因表達(dá)水平，泛素基因被使用作為本研究的內(nèi)參，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系為: 20 μL反應(yīng)體系中加入2× SuperReal PreMix 10 μL，50×Ro×Reference Dye 1 μL，上游引物OsAnn8-F和下游引物OsAnn8-R各0.5 μL，RNase-free ddH2O 6 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 10 min; 94 ℃變性15 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 敲除靶位點(diǎn)的選擇、靶點(diǎn)接頭分子的設(shè)計(jì)及克隆 選擇位于靶基因外顯子PAM前的20個(gè)堿基作為靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)序列合成2條帶有接頭的寡聚靶點(diǎn)接頭分子OsAnn8-Oligo1和OsAnn8-Oligo2 (表1)，接頭分子的設(shè)計(jì)、復(fù)性和克隆參照沈春修[21-22]報(bào)道的方法進(jìn)行。

1.2.5 目標(biāo)基因的敲除靶位點(diǎn)突變檢測(cè) 參照目標(biāo)基因OsAnn8靶位點(diǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異引物TB-OsAnn8F和TB-OsAnn8R，對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)基因的靶位點(diǎn)使用全式金pfu高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送樣測(cè)序。對(duì)靶位點(diǎn)測(cè)序檢測(cè)到堿基突變或者測(cè)序峰圖出現(xiàn)重疊峰的個(gè)體，再次對(duì)該個(gè)體的靶位點(diǎn)序列進(jìn)行擴(kuò)增并完成T載體大腸桿菌克隆，而后送4～6個(gè)克隆進(jìn)行靶位點(diǎn)的測(cè)序，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃ 5 min 預(yù)變性；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸11 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下水稻幼苗OsAnn8基因表達(dá)的熒光定量分析

以TP309幼苗葉片作為試驗(yàn)材料，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析了水稻OsAnn8基因在不同干旱處理時(shí)間下的表達(dá)情況。結(jié)果如圖1 所示, 在干旱處理前,OsAnn8表達(dá)量較高, 干旱處理3 d后表達(dá)量出現(xiàn)大幅度下調(diào)，為處理前的0.08倍，當(dāng)干旱處理4 d后，表達(dá)量較處理3 d后的水稻又有一定幅度回升，為處理前的0.14倍。OsAnn8基因在干旱脅迫處理前后表達(dá)量表現(xiàn)出高-低-高的變化規(guī)律。

柱形圖上方不同字母代表不同處理時(shí)間段差異顯著(P<0.05)。圖2同。Different letters donate significant difference (P<0.05) between different stress treats.The same as Fig.2.

2.2 冷脅迫處理下水稻幼苗OsAnn8基因表達(dá)的熒光定量分析

同樣以TP309幼苗葉片作為試驗(yàn)材料，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析了OsAnn8基因在冷脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2 所示, 在冷脅迫處理之前,OsAnn8表達(dá)量較低, 冷脅迫處理1 d后表達(dá)量達(dá)到最高, 為處理前的48.4倍，冷脅迫處理2 d后表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào),但仍比處理前的表達(dá)水平高，為處理前的5.7倍，冷脅迫處理3 d后表達(dá)量繼續(xù)下調(diào), 但還是比冷脅迫處理之前的表達(dá)量高，為處理前的1.7倍。OsAnn8基因在冷脅迫處理前后表達(dá)量呈現(xiàn)出低-高-低-低的變化規(guī)律。

圖2 水稻OsAnn8基因冷脅迫下表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of OsAnn8 in rice under cold stress

2.3 OsAnn8靶位點(diǎn)的基因編輯克隆載體構(gòu)建

選擇在目標(biāo)基因OsAnn8的第4外顯子序列上設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，將完成復(fù)性的OsAnn8的雙鏈靶點(diǎn)接頭與經(jīng)BbsⅠ稀有內(nèi)切酶酶切后的CRISPR/Cas9克隆載體psgR-Cas9-Os進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取單菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定，由于靶位點(diǎn)接頭只有20個(gè)堿基長(zhǎng)度，不適宜進(jìn)行插入片段的質(zhì)粒酶切鑒定，本研究根據(jù)psgR-Cas9-Os載體sgRNA序列的上游存在的M13位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游引物M13-F，而后與下游的其中一條寡聚靶點(diǎn)接頭分子OsAnn8-Oligo2一起通過(guò)菌液PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)挑取的4個(gè)單菌落克隆都擴(kuò)增出了約250 bp大小的片段，此片段大小剛好與預(yù)期目的片段的大小相符，而以psgR-Cas9-Os空載體做模板的陰性對(duì)照沒(méi)有能夠擴(kuò)增出相應(yīng)目的條帶，表明目標(biāo)基因OsAnn8靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas9克隆載體Cas9-OsAnn8已經(jīng)成功構(gòu)建(圖3)，陽(yáng)性克隆測(cè)序后的序列比對(duì)分析也證實(shí)了這一結(jié)果。

2.4 OsAnn8基因靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體構(gòu)建

OsAnn8靶位點(diǎn)基因編輯植物表達(dá)載體的具體構(gòu)建方法如圖4所示，首先使用快切限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切測(cè)序正確的OsAnn8靶位點(diǎn)的重組質(zhì)粒Cas9-OsAnn8，1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離后， 純化回收攜帶Cas9核酸剪切酶基因和引導(dǎo)RNA序列的5.6 kb DNA片斷，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后同樣攜帶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ黏性末端的pSK51植物表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌后涂板，15 h后挑取3個(gè)單菌落克隆搖菌，然后抽提質(zhì)粒DNA，同樣使用上述2個(gè)限制性內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)進(jìn)行質(zhì)粒克隆的陽(yáng)性鑒定，結(jié)果表明,3個(gè)單菌落克隆酶切后都出現(xiàn)了一條約11 kb的載體大片段和一條約5.6 kb的插入片段，說(shuō)明OsAnn8的CRISPR/Cas9基因編輯植物表達(dá)載體pSK51-Cas9-OsAnn8已經(jīng)成功構(gòu)建(圖5)。

M.DL500; 1-4.陽(yáng)性克隆; 5.空載體陰性對(duì)照。M.DL500 Marker; 1-4.Positive clones; 5.Negative control.

TAM.靶點(diǎn)接頭。TAM.Target adapter molecule.

M.DL15000分子標(biāo)記; 1-3.pSK51-Cas9-OsAnn8陽(yáng)性克隆。M.DL15000 Marker; 1-3.pSK51-Cas9-OsAnn8 positive clones.

2.5 T0轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)基因靶位點(diǎn)序列突變檢測(cè)

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法[23]轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pSK51-Cas9-OsAnn8進(jìn)入到轉(zhuǎn)基因受體品種TP309，經(jīng)過(guò)各個(gè)培養(yǎng)階段的潮霉素篩選后共獲得32株轉(zhuǎn)基因植株 (圖6)。使用目標(biāo)基因OsAnn8第4外顯子上靶位點(diǎn)的側(cè)翼引物TB-OsAnn8F和TB-OsAnn8R (表1), 通過(guò)高保真DNA聚合酶PCR擴(kuò)增T0轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)序列，隨后送樣PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行突變檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在32株T0轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)序峰圖中，其中有2個(gè)單株出現(xiàn)了重疊峰 (圖7)，一個(gè)是T0-22(在PAM前第7個(gè)堿基開(kāi)始出現(xiàn)重疊峰)，另一個(gè)單株是T0-31(在PAM前第4個(gè)堿基開(kāi)始出現(xiàn)重疊峰)，序列比對(duì)結(jié)果也表明,只有這2個(gè)單株的靶位點(diǎn)序列與野生型相比發(fā)生了改變，說(shuō)明本研究已獲得了目標(biāo)基因OsAnn8靶位點(diǎn)成功編輯的2個(gè)突變體單株，緊接著2個(gè)突變體植株突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被分別克隆到T載體上，各自隨機(jī)選擇4～6個(gè)陽(yáng)性克隆送樣進(jìn)行DNA測(cè)序。檢測(cè)到了2種不同類型的NHEJ(非同源端連接)突變：+1(1-bp插入)、-7(7-bp缺失) (圖8)，其中T0-22相比野生型水稻品種TP309缺失了緊連著PAM前的 7個(gè)堿基(CCAGCTA)，而T0-31與野生型水稻品種TP309相比在PAM前第4個(gè)堿基的位置上插入了1個(gè)堿基A, 但2個(gè)都是單等位突變體。

A.愈傷組織培養(yǎng)；B.pSK51-Cas9-OsAnn8農(nóng)桿菌克隆與愈傷組織共培養(yǎng)；C.抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)；D.抗性愈傷組織分化培養(yǎng)；E.轉(zhuǎn)基因植株生根煉苗。A.Callus culture; B.Co-culture of pSK51-Cas9-OsAnn8 agrobacterium clone and callus;C.The resistant callus culture;D.Resistant calli redifferentiation;E.Rooting of transgenic seedling.

PAM.前間區(qū)序列鄰近基序；WT.野生型。圖8同。PAM.Protospacer-adjacent motif；WT.Wild type.The same as Fig.8.

下劃線.靶序列。Underline.Target sequence.

3 結(jié)論與討論

膜聯(lián)蛋白是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)且通過(guò)鈣離子依賴方式與膜磷脂結(jié)合得一類蛋白家族，自從1978年從人類細(xì)胞中克隆出第一個(gè)膜聯(lián)蛋白以來(lái)[24]，目前已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)超過(guò)了1 000個(gè)膜聯(lián)蛋白亞家族成員，其中，人類基因組中發(fā)現(xiàn)了13 個(gè)膜聯(lián)蛋白亞家族成員，擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)基因家族成員[25]，水稻中也發(fā)現(xiàn)了10 個(gè)膜聯(lián)蛋白亞家族成員[20]，相比動(dòng)物膜聯(lián)蛋白基因家族而言，在植物中，膜聯(lián)蛋白基因家族成員較少也比較簡(jiǎn)單，而且基因功能和調(diào)節(jié)機(jī)制方面的研究都有待進(jìn)一步深入。

水稻膜聯(lián)蛋白基因家族10個(gè)成員的編碼區(qū)彼此之間在核苷酸水平上具有45%～83%的序列同源性，在對(duì)應(yīng)的氨基酸水平上也有16%～84%的序列一致性[20]。在植物中，在特定的條件下或特定的細(xì)胞類型中膜聯(lián)蛋白家族基因成員的表達(dá)水平經(jīng)常會(huì)有不同。因此，盡管膜聯(lián)蛋白家族成員之間基因序列非常相似，但是植物膜聯(lián)蛋白家族中不同基因成員仍可能具有不同的功能。

OsAnn8基因是水稻膜聯(lián)蛋白基因家族成員之一，在Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml) 公共數(shù)據(jù)庫(kù)查詢顯示水稻膜聯(lián)蛋白OsAnn8基因全長(zhǎng)1 543 bp，cDNA全長(zhǎng)1 092 bp，共編碼363個(gè)氨基酸，包含4個(gè)外顯子組成。Jami等[20]通過(guò)對(duì)OsAnn8基因上游啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，該基因包含1個(gè)脅迫相關(guān)的順式作用元件DRE/CRT (C-repeat/Drought responsive element)(G/ACCGCC)，而DRE/CRT是植物耐冷調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子CBFs(C-REPEAT BINDING FACTORS)對(duì)冷反應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)基因CBF的表達(dá)蛋白通過(guò)結(jié)合到下游結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子上的CRT/DRE序列元件上, 從而誘導(dǎo)CBF作用的下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá), 使植物的耐寒性提高[26]，這表明OsAnn8有可能作為CBF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游基因參與水稻對(duì)冷脅迫條件的響應(yīng)。

在本研究中2種非生物脅迫環(huán)境下，OsAnn8基因?qū)Ω珊岛偷蜏靥幚矶甲龀隽隧憫?yīng)，在干旱處理3,4 d后表達(dá)量分別下降為處理前的0.08倍和0.14倍。說(shuō)明OsAnn8基因可能通過(guò)負(fù)調(diào)控的方式參與了水稻對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。然而，OsAnn8基因在冷脅迫處理1，2，3 d后，其表達(dá)量則表現(xiàn)出上調(diào)，尤其是4 ℃剛處理1 d后的表達(dá)量達(dá)到最大，為處理前的48.4倍。這說(shuō)明OsAnn8基因可能主要是在水稻遭受冷脅迫環(huán)境后24 h左右起作用，通過(guò)大幅度提高表達(dá)量以正調(diào)控的方式參與水稻對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，幫助水稻抵御冷脅迫條件。盡管水稻OsAnn8基因?qū)Ω珊岛偷蜏孛{迫都作出了響應(yīng)，但卻有所不同，OsAnn8基因?qū)Ω珊得{迫做出了下調(diào)表達(dá)的響應(yīng)，而在低溫脅迫處理后卻做出了上調(diào)表達(dá)的響應(yīng)，這可能是因?yàn)樗綩sAnn8基因通過(guò)不同的調(diào)節(jié)機(jī)制參與了水稻對(duì)干旱和低溫脅迫的響應(yīng)。

利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，本研究成功獲得了水稻OsAnn8基因位點(diǎn)的2個(gè)單等位突變體，下一步將在2個(gè)T0單等位突變體完成自交后，在T1中各自分別篩選出部分OsAnn8基因位點(diǎn)的雙等位突變體與野生型水稻品種TP309一起用于干旱和低溫脅迫處理后的表型鑒定比較分析，因此，本研究為OsAnn8基因在干旱和低溫脅迫環(huán)境下的功能和作用機(jī)理研究提供了重要的突變體材料，對(duì)解析水稻OsAnn8基因在逆境脅迫條件下的生物學(xué)功能具有重要意義。

本研究通過(guò)對(duì)水稻膜聯(lián)蛋白基因家族成員OsAnn8在干旱和低溫脅迫條件下表達(dá)水平的熒光定量分析，證實(shí)OsAnn8參與了水稻對(duì)干旱和低溫脅迫的應(yīng)答，初步了解了OsAnn8在干旱和低溫脅迫條件下的表達(dá)模式及規(guī)律。本研究進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，成功獲得了水稻OsAnn8基因位點(diǎn)的2個(gè)突變體，為OsAnn8基因在非生物脅迫環(huán)境下的功能和作用機(jī)制研究提供了重要的材料基礎(chǔ)，對(duì)解析水稻OsAnn8基因在非生物脅迫條件下的生物學(xué)功能具有重要意義。