陰道鏡活檢聯(lián)合P16、OLFM4診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變的價值觀察

王 靜 杜 欣 馮同富 鄭 嶸 周利敏

湖北省婦幼保健院(武漢，430070)

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性惡性腫瘤，是當下唯一可早期預防和早期診斷的惡性腫瘤[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是宮頸癌前病變的主要疾病狀態(tài)，癌前病變時及時阻斷，完全清除病灶，可有效預防宮頸癌的發(fā)生，改善患者預后轉(zhuǎn)歸[2]。隨著現(xiàn)代分子生物學的快速發(fā)展，學者們逐步發(fā)現(xiàn)生物標志物作為一種特異性物質(zhì)可對宮頸癌及其癌前病變的診斷起到重要的作用[3]。P16基因是一種抑癌基因，可直接參與細胞周期調(diào)節(jié)，近年國外研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的可能機制是高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)表達的E7蛋白與視網(wǎng)膜母細胞瘤(p Rb)蛋白及P53結(jié)合降解失活，導致細胞周期失去抑制，細胞異常增殖惡化而出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化，從而出現(xiàn)P16過表達[4]。OLFM4是新近發(fā)現(xiàn)的抗細胞凋亡的糖蛋白，可促進腫瘤細胞生長和發(fā)展轉(zhuǎn)移，準確反映宮頸上皮細胞增殖分化情況，區(qū)分正常宮頸組織和CIN[5]。但目前國內(nèi)關(guān)于P16、OLFM4診斷CIN的報道較為少見，本研究探討陰道鏡活檢聯(lián)合兩種生物標志物檢測輔助CIN診斷，為宮頸癌的早期診斷、治療和預后評估提供可靠依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017年4月—2019年4月因?qū)m頸病變于本院婦科門診就診，行陰道鏡活檢的CIN患者240例。納入標準：①因接觸性出血或異常陰道出血就診；②有性生活史；③自愿簽署本研究知情同意書。排除標準：①合并自身免疫性疾??；②近期服用過免疫抑制劑；③有宮腔手術(shù)史或放化療史；④急性生殖道炎癥。根據(jù)病理診斷結(jié)果分為CINI(98例)、CINⅡ(82例)、CINⅢ(60例)。選取同期60例因子宮良性病變切除的宮頸標本作為對照組。

1.2 陰道鏡檢查

于月經(jīng)后3～7d行陰道鏡活檢，檢查前48h禁止性生活、陰道沖洗、局部用藥及婦科檢查，儀器選擇Leica MZ6光電一體數(shù)碼電子陰道鏡，由熟練婦科臨床醫(yī)生操作。先將弱酸性醋酸溶液均勻涂抹于宮頸表面定位宮頸可疑病灶，通過陰道鏡觀察分析圖像顏色、構(gòu)型、邊界、血管等特征，發(fā)現(xiàn)肉眼難以觀察到的亞臨床病變及早期癌變部位，診斷參照《陰道鏡診斷圖譜》[6]。

1.3 P16、OLFM4檢測

采用免疫組化法檢測，SP試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，P16抗體、OLFM4抗體購自美國Abcam公司，實驗方法及步驟參照試劑盒說明進行。石蠟切片，HE染色，抗原修復采用高溫高壓修復方法，PBS沖洗3次(3min/次)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次(3min/次)，封閉，滴加一抗，4℃過夜，室溫下復溫30min，PBS沖洗3次(5min/次)，滴加二 抗，37℃15min，PBS沖洗3次(3min/次)，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。以PBS代替一抗作陰性對照，以已知的陽性組織作陽性對照。

1.4 結(jié)果分析

P16陽性為細胞核與胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，OLFM4陽性為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒。根據(jù)陽性細胞所占比例分為：陽性細胞數(shù)＜5%為陰性(－)，5%～25%為弱陽性(＋)，25%～50%為陽性(＋＋)，＞50%為強陽性(＋＋＋)。

1.5 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以%表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 陰道鏡檢查與組織病理診斷

陰道鏡活檢診斷符合率CINI為91.7%、CINⅡ為90.2%，CINⅢ為96.7%。見表1。

表1 病理診斷與陰道鏡檢查[例(%)]

2.2 P16在不同病理宮頸組織中的表達

P16在對照組中陽性表達率為26.7%，低于CIN各 組(χ2＝36.216、57.593、69.474，P＜0.05)；在CINI、CINⅡ、CINⅢ中陽性表達率存在差異(χ2＝5.446、17.323、7.031，P＜0.05)，見表2。圖1～4。

表2 P16在不同病理宮頸組織中的表達(例)

2.3 OLFM4在不同病理宮頸組織中的表達

OLFM4在對照組中陽性表達率為20.0%，低于CIN各 組(χ2＝48.065、71.579、80.000，P＜0.05)；在CINI、CINⅡ、CINⅢ中陽性表達率存在差異(χ2＝5.889、16.481，6.203，P＜0.05)，見 表3。圖5～8。

表3 OLFM4在不同病理宮頸組織中的表達

圖1：P16在慢性宮頸炎中的表達；圖2：P16在CINI中的表達；圖3：P16在CINⅡ中的表達；圖4：P16在CINⅢ中的表達；圖5：OLFM4在慢性宮頸炎中的表達；圖6：OLFM4在CINI中的表達；圖7：OLFM4在CINⅡ中的表達；圖8：OLFM4在CINⅢ中的表達

3 討論

宮頸癌的發(fā)病機制和進展過程是目前唯一明確的、可預防其發(fā)生的惡性腫瘤，多數(shù)宮頸癌并非突然發(fā)生的，而是由正常宮頸組織逐漸發(fā)展為病變組織，再發(fā)展為癌組織的過程。CIN是一種局限于上皮內(nèi)的癌前病變，其進展至宮頸浸潤癌理論上需要一定時間，若能在早期及時采取有效干預措施，可預防宮頸癌的發(fā)生[7]。婦科醫(yī)生僅憑肉眼觀察宮頸組織，極易忽略光滑、輕度糜爛及無特殊癥狀的宮頸，無法根據(jù)糜爛面積、程度判斷病變程度及CIN級別，造成漏診，延誤病情[8]。陰道鏡活檢可鑒別肉眼無法觀察到的宮頸病變，診斷靈敏度高，對部分炎癥及臨床高度懷疑病變患者具重要積極意義，可降低漏診率[9]。本研究顯示，陰道鏡活檢診斷CIN符合率達到90%以上，表明陰道鏡活檢可明顯提高CIN病變的診斷率。但陰道鏡活檢無法取得宮頸管內(nèi)的病變組織，且易受操作者臨床經(jīng)驗影響，取材組織量少，鉗夾深度不夠及定位不準確限制了其對CIN及早期浸潤癌診斷的價值。為了預防宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，國內(nèi)外學者正在試圖尋找一種高靈敏度、高特異性的診斷方法，聯(lián)合生物標記物診斷逐漸被應(yīng)用于宮頸癌的早期篩查[10]。

P16是細胞周期依賴酶抑制因子，可阻止細胞從G1期發(fā)展至S期，反饋調(diào)節(jié)有絲分裂，從而發(fā)揮抑制細胞增值的作用。Mochizuki等[11]發(fā)現(xiàn)，P16在原發(fā)性腫瘤中表現(xiàn)為過表達。HPV病毒感染是宮頸病變的主要致病因素，有研究發(fā)現(xiàn)P16參與了HPV感染引起的宮頸病變進展，CIN中HPV的E6癌蛋白可使p Rb功能失活，喪失其對P16的負反饋調(diào)節(jié)作用，使P16過度表達，無法調(diào)節(jié)細胞周期，進一步刺激細胞不斷增殖，最終導致宮頸病變[12]。國外已有研究發(fā)現(xiàn)[13]，P16陽性表達率越高，細胞生長抑制功能喪失越多，細胞生長和分化程度越高，進一步加重CIN病情，導致其向?qū)m頸癌發(fā)展。本研究中，P16在對照組中陽性表達率低于CIN各組，在CINI中CINⅢ陽性表達率最高，這可能是因為CIN患者宮頸上皮細胞不典型增生破壞了細胞正常周期及狀態(tài)，從而導致細胞增殖加快，加重病情進展。P16表達隨CIN病變程度增加而逐漸升高，可將其作為評價患者疾病分級的輔助指標。

OLFM4是一種可促進腫瘤細胞生長的新型抗凋亡蛋白，Jang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，OLFM4可參與凝集素及鈣粘素的相互作用，對腫瘤細胞的黏附和轉(zhuǎn)移能力有重要影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)[15]，OLFM4高表達可作用于DNA合成的S期、G2/M期，加快細胞周期進程，促進腫瘤細胞增殖；OLFM4也可作用于PI3K/PKB下游，促進腫瘤細胞生長。本研究中，OLFM4在對照組中陽性表達率低于CIN各組，且CINⅢ陽性表達率最高，表明OLFM4可較為準確地區(qū)分正常宮頸組織和CIN組織，反映宮頸細胞增殖和分化情況，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，陰道鏡活檢聯(lián)合P16、OLFM4檢測可對CIN早期進行有效篩查和診斷，及時提供個性化診療方案干預進而減少宮頸癌的發(fā)生。