單核細(xì)胞增生李斯特菌的耐藥特征及機(jī)制

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單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種重要的食源性人獸共患病原菌，其對(duì)食品安全及人類健康的影響已經(jīng)引起很多國(guó)家的高度重視。Lm引起的人和動(dòng)物的李斯特菌病具有低發(fā)病率、高致死率的特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人李斯特菌病發(fā)病率約每百萬(wàn)人0.1～11.3例，死亡率為20%～30%[1]。Lm具有第一代喹諾酮類藥物、磷霉素和第三代頭孢菌素的天然耐藥性，對(duì)臨床上常用于革蘭氏陽(yáng)性菌的各種抗生素均敏感[2]。但1988年[3]首例李斯特菌四環(huán)素耐受株出現(xiàn)以來，不斷有研究報(bào)道從各類食品及臨床病例中分離到一種甚至多種抗生素耐受的菌株[4]。弄清Lm耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制，從而控制多重耐藥菌的產(chǎn)生和傳播，已經(jīng)成為我們面臨的重要工作任務(wù)之一。

1 單核細(xì)胞增生李斯特菌耐藥特征

細(xì)菌耐藥問題一直是國(guó)內(nèi)外的關(guān)注焦點(diǎn)和研究熱點(diǎn)，WHO已將其列為本世紀(jì)最大的公共安全問題之一。長(zhǎng)期以來世界各國(guó)均對(duì)不同來源的Lm的耐藥性進(jìn)行了密切監(jiān)測(cè)，表1展示了不同地區(qū)食品及臨床樣品中分離的Lm的耐藥情況。

在國(guó)內(nèi)，2012年閆韶飛[5]等對(duì)分離自我國(guó)23個(gè)地區(qū)10類食品的635株Lm進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示平均耐藥率為10.39%，多重耐藥率為1.1%，其中生豬肉(26.67%)和生牛肉(25%)中分離的菌株耐藥率最高。2015年Shi W[6]等報(bào)道我國(guó)即食食品來源的Lm耐藥率為67.5%，其中21.25%的菌株對(duì)兩種及以上的抗生素耐受。國(guó)外Lm食品分離株耐藥現(xiàn)狀同樣嚴(yán)峻。Lm污染的生肉、即食食品、水產(chǎn)品、冰淇淋和蔬菜進(jìn)入食物鏈?zhǔn)窃斐蓺W洲、北美洲、亞洲和非洲等地區(qū)爆發(fā)的李斯特菌病的主要原因。在西班牙，Gómez[7]等報(bào)道2009-2012年間分離自肉制品及環(huán)境樣品的206株Lm耐藥率為34.5%，多重耐藥率為2.9%。Chen[8]等報(bào)道美國(guó)水產(chǎn)及環(huán)境樣品中分離的Lm對(duì)頭孢噻肟、克林霉素的耐藥率分別為71%和69%。在馬來西亞，Lm即食食品分離株耐藥率為57.6%，多重耐藥率高達(dá)47.4%，對(duì)青霉素(53%)、四環(huán)素(15.6%)、萬(wàn)古霉素(9.4%)和紅霉素(6.3%)的耐藥尤其顯著[9]。在埃塞俄比亞，Garedew[10]等報(bào)道2012-2013年分離自即食食品的Lm多重耐藥率為16.7%。綜合國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，食品源Lm呈現(xiàn)耐藥率不斷升高和耐藥譜逐漸變寬的趨勢(shì)，無疑給李斯特菌病的臨床用藥造成一定困難。從菌株來源看，國(guó)內(nèi)外動(dòng)物性食品如禽畜肉類、即食食品中分離的Lm具有較高的耐藥水平。據(jù)美國(guó)疾病防控中心統(tǒng)計(jì)，2013年美國(guó)市場(chǎng)上出售的抗生素中73%由獸醫(yī)購(gòu)買[11]。畜牧業(yè)中抗生素的大量使用導(dǎo)致了禽畜肉制品中抗生素的殘留以及從中分離的菌株存在較高的耐藥性。有研究表明，細(xì)菌耐藥性與抗生素的消耗量有關(guān)[12]。一個(gè)典型的例子即四環(huán)素。國(guó)內(nèi)食品源Lm對(duì)四環(huán)素耐藥最為嚴(yán)重[5,13-15]。作為一類廣譜抗生素，四環(huán)素常作為預(yù)防和治療禽畜疾病或促進(jìn)禽畜生長(zhǎng)的飼料添加劑被大量應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)[16]，抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇壓力導(dǎo)致了Lm四環(huán)素耐藥水平的提高。由此可見，細(xì)菌的耐藥性與抗生素的使用密切相關(guān)，對(duì)于使用時(shí)間越久、使用范圍越廣、使用頻率越高的抗生素，耐藥現(xiàn)象越普遍[17]。

目前，臨床上用于治療李斯特菌病的藥物主要為β-內(nèi)酰胺類抗生素(氨芐西林、青霉素)，可單獨(dú)使用或與慶大霉素聯(lián)合使用。常使用的備選治療方案為甲氧芐啶和磺胺類藥物[18]。Lm臨床分離株的耐藥監(jiān)測(cè)對(duì)于科學(xué)合理用藥至關(guān)重要，臨床藥物的誤用或過度使用是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要原因。孫照琨[19]等對(duì)1963-2013年間國(guó)內(nèi)臨床Lm耐藥率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，復(fù)方新諾明、慶大霉素、丁胺卡那霉素、青霉素、環(huán)丙沙星和氨芐西林總體耐藥率較高，分別為40.9%、23.0%、21.7%、18.9%、14.3%和11.1%。國(guó)外臨床分離株耐藥性同樣不容樂觀。Hansen J M[20]等報(bào)道1958-2001年間丹麥Lm臨床分離株對(duì)慶大霉素(1.9%)、復(fù)方新諾明(6%)和環(huán)丙沙星(0.9%)耐受。在葡萄牙，Magalhaes R[21]等對(duì)Lm臨床分離株進(jìn)行耐藥檢測(cè)，結(jié)果顯示環(huán)丙沙星、利福平、呋喃妥因和鏈霉素的耐藥率分別為24.1%，13.8%，41.4%和58.1%，其中有29株(14.3%)對(duì)兩種及以上抗生素耐藥。Morvan[22]等報(bào)道1926-2007年間法國(guó)臨床分離的4 816株Lm耐藥率為1.27%，主要耐受四環(huán)素和喹諾酮類抗生素。1970-2008年間巴西Lm臨床分離株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示利福平、復(fù)方新諾明耐藥率分別為1.5%和2.9%[23]。Borcan[24]等對(duì)2009-2013年間羅馬尼亞Lm臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示氨芐西林、青霉素耐藥率均為7.7%。綜上所述，盡管Lm臨床分離株的耐藥率和耐藥種類在地區(qū)上存在差異，但許多國(guó)家均出現(xiàn)對(duì)氨芐西林、青霉素等臨床一線藥物耐受甚至多重耐藥的報(bào)道，這無疑會(huì)導(dǎo)致臨床經(jīng)驗(yàn)性治療難以奏效，給重癥感染患者的治療帶來巨大困難。整體來看，臨床和食品來源Lm均對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺類等抗生素表現(xiàn)出耐藥性，提示耐藥菌株存在經(jīng)食品加工、銷售環(huán)節(jié)傳染給消費(fèi)者的潛在風(fēng)險(xiǎn)，且部分人群因長(zhǎng)期使用抗生素又會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)。

表1 不同地區(qū)食品及臨床樣品中分離的Lm耐藥株Tab.1 Antibiotic-resistant Lm isolated from food and clinical in different regions

2 單核細(xì)胞增生李斯特菌耐藥機(jī)制

在抗生素的選擇性壓力下，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，特別是多重耐藥性菌株，而耐藥菌株通過動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈從農(nóng)場(chǎng)到餐桌，最終造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此，弄清Lm的耐藥機(jī)制對(duì)于李斯特菌病的預(yù)防和控制將具有重要意義。Lm的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，包括可移動(dòng)元件介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移、藥物作用靶點(diǎn)的改變、藥物的外排作用、鈍化酶或滅活酶的產(chǎn)生、生物被膜等多種機(jī)制。

2.1可移動(dòng)元件介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移 不耐藥的Lm可以通過獲得攜帶抗生素耐藥基因的可移動(dòng)元件產(chǎn)生耐藥性。轉(zhuǎn)座子、整合子和質(zhì)粒等可移動(dòng)元件在腸球菌和鏈球菌中普遍存在，并能在腸球菌、鏈球菌和李斯特菌內(nèi)部及各菌種之間傳遞[25]。與四環(huán)素耐藥密切相關(guān)的Tn916是一種廣宿主接合性轉(zhuǎn)座子，與Tn1545一起被稱為Tn916/Tn1545家族。Tn916通常攜帶有tet(M)基因。tet(M)基因能通過接合作用從無害李斯特菌轉(zhuǎn)移到Lm、綿羊李斯特菌和糞腸球菌，也可從糞腸球菌轉(zhuǎn)移到Lm[26]。Tn1545在體內(nèi)外都能通過接合作用從糞腸球菌轉(zhuǎn)移到Lm[27]。質(zhì)粒pIP501宿主范圍廣泛，可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈霉素類抗生素的耐藥性。pIP501可通過接合作用進(jìn)入Lm胞內(nèi)并進(jìn)行復(fù)制，并能在李斯特菌屬和鏈球菌之間轉(zhuǎn)移[28]。

2.2藥物作用靶點(diǎn)的改變Lm能通過改變或修飾抗菌藥物結(jié)合靶位或使得藥物作用的靶基因發(fā)生突變，使得靶基因表達(dá)產(chǎn)物的空間構(gòu)型與理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素變得不敏感。Lm中存在的四環(huán)素耐藥基因tet(M)、tet(S)能通過編碼的核糖體保護(hù)蛋白(RPPS)與核糖體結(jié)合，從而阻止四環(huán)素對(duì)細(xì)菌蛋白合成的抑制作用，從而產(chǎn)生耐藥性。Lm細(xì)胞膜上存在至少5種青霉素結(jié)合蛋白(PBP)，β-內(nèi)酰胺類抗生素通過與PBPs結(jié)合，抑制了細(xì)菌細(xì)胞壁的合成從而引起細(xì)胞死亡。而當(dāng)細(xì)胞膜上PBPs數(shù)量減少或結(jié)構(gòu)改變，抗生素與其結(jié)合力便顯著降低，就會(huì)產(chǎn)生耐藥[29]。部分Lm耐藥菌株具有ermB、ermC基因，能夠編碼紅霉素核糖體甲基化酶，降低核糖體與抗生素的結(jié)合力，介導(dǎo)Lm對(duì)紅霉素的高水平耐藥[30]。

2.3藥物的外排作用 藥物外排泵是位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的一類功能性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度達(dá)到某一臨界值時(shí)，細(xì)菌能依靠主動(dòng)外排泵出機(jī)制來降低細(xì)菌體內(nèi)藥物的濃度，從而使菌體產(chǎn)生耐藥表型。對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等細(xì)菌，外排泵導(dǎo)致的耐藥是其耐藥的主要原因。Lm中存在MdrL和Lde兩種外排泵，分別由mdrL和lde基因編碼[31]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、頭孢噻肟以及重金屬和溴化乙錠均由MdrL泵出；Lde屬于細(xì)菌外排系統(tǒng)中常見的主要易化子超家族(Major facilitator superfamily, MFS)，是一種自足型多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與Lm的喹諾酮耐藥性密切相關(guān)，可利用質(zhì)子偶聯(lián)交換產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力外排多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的底物，從而降低細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)物質(zhì)的濃度。

2.4鈍化酶或滅活酶的產(chǎn)生 產(chǎn)生滅活酶是引起細(xì)菌耐藥性的機(jī)制之一。細(xì)菌產(chǎn)生的滅活酶主要有β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶等，這些酶可破壞抗生素或使之失去抗菌作用，使藥物作用于菌體前就被破壞或失活。細(xì)菌由質(zhì)粒介導(dǎo)或染色體突變而產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，通過水解和非水解方式(酶與抗生素結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物)破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)，使抗生素失活。氨基糖苷類修飾酶是細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制，其主要催化氨基糖苷類藥物氨基或羥基的共價(jià)修飾，使得氨基糖苷類藥物與核糖體的結(jié)合減少，促進(jìn)藥物攝取的EDP-II也被阻斷而產(chǎn)生耐藥性[32]。有報(bào)道Lm通過在腸球菌-鏈球菌中廣泛存在的aad6基因，產(chǎn)生6-N-鏈霉素腺苷?；D(zhuǎn)移酶，從而產(chǎn)生對(duì)鏈霉素的耐受[33]。

2.5細(xì)菌生物被膜的形成 生物被膜通過多種機(jī)制相互協(xié)調(diào)參與耐藥形成，如通過屏障作用減少抗菌藥物的滲透、形成類似芽孢細(xì)胞的狀態(tài)使細(xì)菌對(duì)抗菌藥物不敏感、細(xì)菌傳感效應(yīng)的調(diào)節(jié)等。有報(bào)道細(xì)菌在生物被膜狀態(tài)下更容易吸收外源基因進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，從而利于耐藥基因的獲得[34]。細(xì)菌形成生物被膜后，能抵抗百倍以上正常劑量的藥物，呈高度耐藥[35]。影響Lm生物被膜形成的關(guān)鍵因子有鞭毛糖蛋白、胞外DNA、胞外多糖、胞外結(jié)合蛋白和群體感應(yīng)系統(tǒng)等[36]。鞭毛調(diào)節(jié)因子DegU通過調(diào)控鞭毛糖蛋白基因的轉(zhuǎn)錄直接影響生物被膜的形成。胞外DNA參與Lm粘附和生物被膜早期的形成，并與胞外多糖、胞外結(jié)合蛋白共同組成胞外基質(zhì)。Lm的Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)可以直接正調(diào)控生物膜，也可通過調(diào)控毒力因子、耐藥因子間接調(diào)控生物膜，是一種整體水平的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系。

3 展 望

李斯特菌病作為一種由Lm感染引起的食源性疾病，不僅影響食品安全甚至危及人類生命。近年來國(guó)內(nèi)外食品及臨床分離的Lm耐藥譜逐漸變寬，中國(guó)、丹麥、巴西、羅馬尼亞等國(guó)均出現(xiàn)對(duì)氨芐西林、青霉素等臨床一線藥物耐受甚至多重耐藥菌株的報(bào)道。耐藥菌株通過動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈從農(nóng)場(chǎng)到餐桌進(jìn)行傳播，對(duì)公眾健康帶來威脅，最終造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)各種來源的Lm的分子流行病學(xué)研究及耐藥性監(jiān)測(cè)，臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎、合理使用抗生素，減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。弄清Lm的耐藥機(jī)制對(duì)于李斯特菌病的預(yù)防和控制同樣具有重要意義。

利益沖突：無