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    Sigma E基因對恥垢分枝桿菌五種藥物敏感性的影響及機制研究

    2019-03-07 08:40:32,,,,,,,
    中國人獸共患病學報 2019年2期
    關鍵詞:天青菌液結核

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    SigE是結核分枝桿菌的重要毒力因子[1]。它在正常時不表達,在低氧、營養(yǎng)缺乏、偏酸偏堿等不利環(huán)境下才轉錄表達,參與細菌的應激反應,維持細菌生存[2]。近年的研究發(fā)現(xiàn),SigE與結核分枝桿菌的潛伏與持留密切相關,滅活結核分枝桿菌的SigE會中斷潛伏持留的細菌復蘇過程[3]??股貙毦彩且环N應激,但目前關于SigE參與抗生素應激、影響抗生素敏感性及機制的報道較少。SigE是否通過促進結核分枝桿菌進入持留狀態(tài),從而影響抗生素的敏感性有待進一步研究。

    本實驗以恥垢分枝桿菌作為模式菌[4],首先構建SigE表達的重組恥垢分枝桿菌,采用刃天青作為指示劑的微量滴定板法檢測SigE表達菌對常用抗結核藥物的敏感性??寺”磉_結核分枝桿菌RpfE,抗生素誘導細菌進入非復制持留狀態(tài),利用RpfE促進持留菌的生長的作用,通過測定復蘇指數(shù)來了解持留對抗生素敏感性的影響機制。

    1 材料與方法

    1.1質粒和菌株 pET-32a(+)質粒、 pMV261質粒、E.coliDH5和恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis,MS)由實驗室保存,結核分枝桿菌H37Rv滅活樣本由重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸科提供。

    1.2主要試劑 通用型DNA純化膠回收試劑盒、DNA marker從寶生物工程有限公司購買;限制性內切酶XhoI、EcoRI等從Themo公司購買;KODFX PCR 聚合酶買自 TOYOBO 公司;SDS-PAGE膠試劑盒從EpiZyme公司購買;小鼠抗His單克隆抗體購自Bioworld Technology公司; DAB 顯色劑于康為世紀生物科技有限公司購買;異煙肼、利福平等抗生素買自北京睿博興科生物技術有限公司。

    1.3引物設計和蛋白純化 本實驗相關的測序、引物合成由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公提供;結核分枝桿菌RpfE克隆部分由實驗室完成,純化技術部分由通用生物科技有限公司完成。

    1.4sigE基因克隆與表達 設計上游下游引物擴增sigE基因(5′-ATAGAATTCCATCATCACCA TCACCATATGGAACACGACGACCGTCG-3′,5′- ACGAAGCTTTCAGGCGGACTGTGCGGTT-TC-3′,下劃線為EcoR I、HindIII酶切位點,斜體為6個組氨酸編碼序列。用MS為模板,-80 ℃反復凍融兩次,PCR擴增條件是:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,共32次循環(huán),72 ℃ 15 min。經雙酶切,再將sigE基因連接到pMV261多克隆位點構建重組質粒(pMV261-SigE),再雙酶切、測序進行鑒定正確后,電轉儀調至2.7 kV、4 ms,pMV261-sigE重組質粒電轉入MS感受態(tài)細菌中構建重組菌pMV261-sigE/MS,重組菌經菌落PCR驗證。同時構建只含pMV261的重組菌pMV261/MS用作實驗對照。將細菌培養(yǎng)到OD600為0.8~1.0左右,用42 ℃誘導3 h,超聲碎菌,Western blot檢測SigE蛋白的表達。

    1.5rpfE基因克隆與表達 用MTB H37Rv滅活樣本為模板,設計引物(5′- CGTCTCGAGTTGAAGAACGCCCGTACGA-3′, 5′-ATAGAATTCTCAGCCGCGGCGGCCGCAG -3′),酶切位點分別為XhoI、EcoR I,PCR條件為:95 ℃ 8 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共34次循環(huán),72 ℃ 10 mins;雙酶切后連接到pET-32a(+)質粒中構建pET-32a(+)-rpfE重組質粒,酶切、測序鑒定正確。pET-32a(+)-rpfE轉入BL21后經0.1 mol/L的IPTG誘導表達Rpf E,Western blot檢測蛋白的表達。Rpf E蛋白的純化復性由重慶通用生物科技有限公司完成。

    1.6微量滴定板藥敏試驗[5]用滅菌蒸餾水配1%的刃天青儲存液,然后過濾除菌分裝,放4 ℃保存。取對數(shù)生長期的細菌7H9洗滌兩次,用培養(yǎng)基重懸調OD600為0.5,此時菌液的濃度為4×106CFU/mL左右,取100 μL于96孔板。參考文獻,稀釋所需藥物濃度,按100 μL/孔的量加入以上已加入菌液的96孔板中。放37 ℃孵育24 h。取刃天青稀釋成0.1%,每孔加入20 μL繼續(xù)37 ℃孵育12 h,在酶標儀上讀取相對熒光值(激發(fā)535 nm和發(fā)射590 nm),每個樣本設定陽性對照(只加菌液不加抗生素),陰性對照(只加7H9不加菌),計數(shù)每孔的熒光值相對陽性對照孔的百分比。

    1.7測定細菌生存率 取對數(shù)生長期的細菌用7H9洗滌2次,用培養(yǎng)基重懸調OD600為0.5。取500 μL菌液,500 μL稀釋好的抗生素于一管,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。分別在0 h、12 h,取每個濃度的菌液100 μL,7H9液體培養(yǎng)基等倍梯度稀釋,每個稀釋濃度取10 μL滴到7H9固體平板上,每次3個平行,放于37 ℃培養(yǎng)箱3~5 d后取出,菌落形成單位(Colony-Forming Units,CFU)計數(shù),得到兩次CFU值,計算細菌生存率比較藥敏情況。

    1.8復蘇指數(shù)的測定[6]將細菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期,調OD600一致為0.5,7H9抗性培養(yǎng)基洗滌菌體兩次,離心后用濃度分別為異煙肼100 μg/mL、利福平25 μg/mL、乙胺丁醇10 μg/mL、左氧氟沙星10 μg/mL,環(huán)丙沙星10 μg/mL 的7H9培養(yǎng)基重懸,放入37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。24 h后8 000 r/min離心去上清,用新鮮的7H9培養(yǎng)基重懸,此時將重懸液平均分為兩管,一管用等倍梯度稀釋至106,取每個濃度的菌液10 μL滴到7H9固體平板,于37 ℃培養(yǎng),3~5 d后計數(shù)CFU;另一管用加有終濃度為20 ng/mL RpfE的7H9等倍梯度稀釋至1010,每濃度取200 μL于96孔板,每濃度做3個平行,96孔板邊緣四周不加樣,用200 μL培養(yǎng)基封板,將平板在37 ℃下靜態(tài)培養(yǎng)2周,觀察記錄陽性細菌的孔,查表得到最大可能數(shù)(Most probable number,MPN)值[7]。復蘇潛力以log10(MPN)-log10(CFU)計算的復蘇指數(shù)(Resuscitation Index, RI)來表示,所涉及的7H9培養(yǎng)基都加有50 μg/mL的卡拉霉素。

    1.9統(tǒng)計分析 IBM SPSS Statistics 19軟件進行,數(shù)據(jù)用均值±標準差來表示,采用t檢驗,進行連續(xù)變量的統(tǒng)計學差異分析,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1sigE基因和rpfE基因的克隆構建和表達結果 用MS基因組作為模板,PCR擴增出大小約為744 bp的sigE基因條帶(圖1),經EcoR I、HindIII酶切質粒pMV261-sigE,可見約4 400 bp 、744 bp 大小的兩個片段與預期一致(圖2)。滅活的MTB H37Rv菌株基因為模板擴增出519 bp 左右的rpfE基因條帶(圖3),pET-32a(+)-rpfE經XhoI、EcoR I雙酶切鑒定得到約519 bp,5 880 bp的兩片段與預期一致(圖4)。

    M: DNA Marker 10 000圖1 sigE基因的PCR擴增產物Fig.1 PCR product of sigE gene

    M: DNA Marker 10 000圖2 pMV261-SigE雙酶切鑒定Fig.2 pMV261-SigE identification with double enzyme digestion

    M: DNA Marker 10 000圖3 rpfE基因擴增條帶Fig.3 PCR product of rpfE gene

    用抗His標簽作為一抗(1∶4 000),Western blot檢測pMV261-sigE重組垢分枝桿菌后SigE表達,大小為32 kDa左右;pET-32a(+)-rpfE轉入BL21后經0.5mmol/L IPTG誘導表達,大小為40kDa左右,與預期一致(圖5)。

    M: DNA Marker 10 000圖4 pET-32a(+)-rpfE雙酶切鑒定Fig.4 pET-32a(+)-rpfE identification with double enzyme digestion

    注:M:蛋白maker;1:純化的RpfE蛋白;2:pET-32a(+)-RpfE/BL21碎菌后的上清;3、4:分別是pMV261-sigE/MS熱誘導3 h碎菌液的上清、沉淀;5、6:pMV261/MS熱誘導3 h碎菌液的上清、沉淀

    注:*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001。

    2.2微量滴定板藥敏試驗 用刃天青作為指示劑,讀取不同濃度藥物作用后的相對熒光值,檢測活菌數(shù)比例以此來監(jiān)測藥敏情況。與僅含pMV261空載的重組恥垢分枝桿菌對相比,pMV261-SigE重組恥垢分枝桿菌對異煙肼(isoniazid,INH), 利福平(rifampin, RIF)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、左氧氟沙星(levofloxacin,LVFX)、環(huán)丙沙星(ciprofloxaci,CPFX)幾種抗結核藥物相對熒光值高(圖6),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    2.3純化的RpfE蛋白的活性鑒定 抗生素治療分枝桿菌可誘導不同代謝形式的分枝桿菌產生[8],我們用INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX處理恥垢分枝桿菌2天,然后用添加或不添加RpfE蛋白比較恥垢分枝桿菌復蘇情況,使用CFU和MPN計數(shù),計算復蘇指數(shù)評估復蘇情況。顯示7H9對照組未觀察到有意義的復蘇,復蘇指數(shù)都顯示為負值;而添加RpfE蛋白進行復蘇的恥垢分枝桿菌復蘇指數(shù)均為正值(圖7),差異有統(tǒng)計學意義(t(INH)=-17.00,P<0.000 1;t(RIF)=-6.37,P<0.01;t(EMB)=-3.71,P<0.05;t(LVFX)=-4.57,P<0.05),表明有復蘇活性,能促進藥物誘導的持留恥垢分枝桿菌生長。

    注: *P<0.05,** P<0.01,****P<0.0001。

    2.4SigE表達影響藥物誘導的持留菌復蘇 分別用高濃度的INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX處理pMV261-SigE/MS 和pMV261/MS 48 h,藥物誘導非復制持留菌產生,然后在含有20 ng/mL RpfE蛋白的7H9促進復蘇,比較兩組菌復蘇情況,計算復蘇指數(shù)。與對照相比,INH、EMB兩種藥處理后SigE重組菌復蘇指數(shù)是明顯高于對照組(圖8),差異有統(tǒng)計學意義(t(INH)=5.82,P<0.01;t(EMB)=11.08,P<0.001)。

    注: ** P<0.01,***P<0.001。

    2.5細菌生存率檢測 通過菌落計數(shù)SigE重組菌株、空載菌株藥物作用前后生存率。與對照組相比,SigE表達組細菌對INH、RIF、EMB幾種抗結核藥物生存率高;而LVFX、CPFX 2個藥物在活菌計數(shù)計算生存率的藥敏方法中沒有表現(xiàn)出差異(圖9)。

    注: *P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001。

    3 討 論

    由于在普通的培養(yǎng)條件下不表達SigE分子,不利于實驗效應的觀察。本實驗構建表達SigE的重組恥垢分枝桿菌的實驗菌株和空質粒重組恥垢分枝桿菌的對照菌株,以便突顯SigE分子的效應。在研究SigE對抗結核藥物的敏感性檢測中采用刃天青微量滴定板和菌落計數(shù)計算存活率兩種方法來進行藥敏試驗。刃天青是一種氧化還原指示劑,活性細菌可將其還原,染料由深藍色變?yōu)榉奂t色[9],粉紅色的刃天青能夠產生很高的熒光信號,無活性的細菌因無代謝能力,所以不具有還原性,不被還原的深藍色刃天青不能產生熒光信號,基于這樣的原理,用酶標儀記錄 535Ex/590Em熒光值可以用于檢測活性細菌[5]。刃天青微量滴定板法操作簡便、快速、成本低廉和結果準確[10]。結果顯示INH、RIF、EMB 3種不同藥物濃度作用后兩種方法結果一致,SigE表達菌比空質粒對照菌相對熒光值高,同時細菌生存率高,即細菌對藥物表現(xiàn)出更強的耐受性;氟喹諾酮類的LVFX、CPFX 2個二線抗結核藥物表現(xiàn)出SigE表達菌比對照菌相對熒光值高,然而菌落計數(shù)計算生存率的藥敏方法沒有顯示出具有統(tǒng)計學意義的差異。兩種方法不一致的具體原因還不明確,我們分析首先可能是兩種方法存在差異,前一種我們評估細菌的活力(在液體培養(yǎng)氧化的能力),而在后一種評估的活細菌的數(shù)量;再者,細菌暴露于各種壓力條件下可能產生具有不同培養(yǎng)要求[11]和生物化學特性[8]的異質分枝桿菌種群。

    根據(jù)已有的研究結果,潛伏在肉芽腫細胞或巨噬細胞內的結核分枝桿菌SigE高表達,這提示SigE與結核分枝桿菌的潛伏和持留密切相關[12]。當結核分枝桿菌在體外缺氧或饑餓條件下的研究表明,會啟動SigE的轉錄表達,促使結核分枝桿菌可以進入非復制持留狀態(tài)[13]。因此,我們推測SigE是否通過促進細菌持留而使細菌的敏感性降低。實際上,結核分枝桿菌處于非復制的持留狀態(tài)對藥物的失去敏感性已被廣泛關注,預防或阻止分枝桿菌進入非復制的持留狀態(tài)成為研究的新型治療策略和靶點[14]。由于結核分枝桿菌復蘇促進因子(Rpf)可以促進非復制的持留菌復蘇生長[15],我們構建了重組的有活性RpfE因子來觀察SigE誘導持留菌形成的情況。在抗生素處理后的SigE表達菌在含RpfE因子的培養(yǎng)基中觀察到最大可能數(shù)MPN包括持留菌在內的所有活菌,在不含RpfE因子培養(yǎng)基的菌落CFU則只含活菌不含持留菌,兩種之差表現(xiàn)為復蘇指數(shù)RI反應持留菌的多少。實驗采用INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX幾種抗生素作用于SigE表達菌,觀察到INH、EMB兩種藥處理后SigE重組恥垢分枝桿菌復蘇指數(shù)是明顯高于對照組,而其他幾種抗生素的復蘇指數(shù)與對照組無明顯差異。不同抗生素處理出現(xiàn)持留菌不同的結果,我們推測可能與SigE的作用特點和抗生素的作用機制有關。SigE屬于胞漿外選擇性σ因子家族,該家族因子主要對胞外刺激信號或作用于細胞表面應激信號有關[16],INH和EMB都是作用于細胞壁合成的抗結核藥物[17]。我們研究的結果與Pendzich和Pisu等觀察到的結果類似[5]。

    近年來耐藥結核病不斷涌現(xiàn)[18],增加了結核病控制和治療的難度[19]。通過本實驗,我們發(fā)現(xiàn)SigE的表達可促進細菌進入持留狀態(tài)影響INH和EMB作用的敏感性,這可能是影響作用分枝桿菌細胞壁表面成分合成類抗結核藥物敏感性的重要原因。雖然恥垢分枝桿菌是結核分枝桿菌的模式菌,但必定不是致病菌,所以有必要后續(xù)在結核分枝桿菌中驗證SigE是否也有相同的作用。此外,結核分枝桿菌持留涉及的信號通路復雜,且SigE是一個轉錄調節(jié)因子,那么它影響細菌持留的具體通路是怎樣的,有待進一步深入研究,有利于抗持留菌新藥的開發(fā)。

    利益沖突:無

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