2009-2017年江蘇省手足口病病原譜及柯薩奇A16型的分子流行病學(xué)研究

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手足口病(Hand, foot and mouth disease，HFMD)是一種由多種腸道病毒引起的急性傳染病，多發(fā)于5歲以下兒童[1-3]。大多數(shù)患者以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征，病程5～7 d，一般預(yù)后良好，但少數(shù)重癥患者可迅速出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等全身并發(fā)癥，如腦炎、腦膜炎、急性弛緩性麻痹、肺水腫和心肌炎等，該類患者病情進(jìn)展快，易發(fā)生死亡。手足口病傳染性強(qiáng)，傳播機(jī)制容易實(shí)現(xiàn)，托幼機(jī)構(gòu)等集體單位由于易感者集中，容易發(fā)生聚集性和暴發(fā)疫情[4-5]，處置不當(dāng)可在短時(shí)間內(nèi)造成較大規(guī)模的暴發(fā)流行。自2009年至2017年全國(guó)累計(jì)報(bào)告HFMD 17 694 904例，重癥病例數(shù)149 227例，死亡3 506人，發(fā)病數(shù)居法定傳染病首位。HFMD在我國(guó)的流行造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，給公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。

在我國(guó)，手足口病基本上是由腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CVA16)引起為主[6-8]，HFMD重癥和死亡病例的病原構(gòu)成以EV7l占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。CVA16引起的手足口病癥狀較輕，較少有并發(fā)癥發(fā)生。但近年來(lái)，幾起比較嚴(yán)重的手足口疫情均是由EV71和CVA16的共同循環(huán)導(dǎo)致[9-10]，EV71和CVA16混合感染亦有報(bào)道[11-12]，而疫情監(jiān)控和疫苗研發(fā)則主要集中于EV71。此外，我國(guó)自主研制的EV71滅活疫苗已于2015年12月獲批上市， EV71滅活疫苗的廣泛接種可能會(huì)使流行毒株從EV71向CVA16或其他腸道病毒轉(zhuǎn)移。本研究對(duì)2009-2017年江蘇省手足口病病原譜進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)CVA16 VP1 基因進(jìn)行進(jìn)化分析，以明確江蘇省手足口病的病原譜流行情況及CVA16的分子流行病學(xué)特征。通過(guò)對(duì)疫苗使用前后江蘇省CVA16的流行趨勢(shì)和病原學(xué)變遷進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，為本省HFMD的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1資料和標(biāo)本來(lái)源 手足口病病例資料來(lái)源于“中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”，收集2009-2017年江蘇省手足口病報(bào)告病例個(gè)案、人口學(xué)信息(性別和出生日期)、病原學(xué)結(jié)果(EV71、CVA16、其他腸道病毒)、病例類型(臨床診斷病例、實(shí)驗(yàn)室診斷病例、重癥病例)等信息，其中CAV16病例為發(fā)病日期在2009-2017年間實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為CVA16核酸檢測(cè)陽(yáng)性的HMFD病例。標(biāo)本來(lái)源于2009-2017年江蘇省13個(gè)地級(jí)市按照江蘇省手足口病監(jiān)測(cè)工作方案要求上送至江蘇省疾病預(yù)防控制中心的CVA16核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本(咽拭子或肛拭子)。

1.1.2病例定義 臨床診斷病例是發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無(wú)發(fā)熱。臨床診斷病例符合下列條件之一，即為實(shí)驗(yàn)室診斷病例：特異性RNA檢測(cè)陽(yáng)性、病毒分離陽(yáng)性或急性期與恢復(fù)期血清中和抗體有4倍或4倍以上的升高。重癥病例是出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累、呼吸及循環(huán)功能障礙等表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室檢查可有外周血白細(xì)胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、腦脊髓磁共振、胸部X線、超聲心動(dòng)圖檢查異常[13]。

1.1.3儀器與試劑 全自動(dòng)核酸提取儀MagNA Pure LC及配套試劑購(gòu)自Roche公司，QIAxcel毛細(xì)管電泳儀及配套試劑購(gòu)自QIAGEN公司，OneStep RT-PCR Kit購(gòu)自QIAGEN公司，胎牛血清、青霉素和Opti-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1病毒分離 將核酸檢測(cè)結(jié)果為CVA16陽(yáng)性的標(biāo)本接種于人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞，采用含2%胎牛血清、100 U/mL青霉素的Opti-MEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5～7 d，每日觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)，盲傳兩代，若出現(xiàn)細(xì)胞病變，收獲培養(yǎng)上清液，并儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.2.2核酸提取 按照Roche公司MagNA Pure LC全自動(dòng)核酸提取儀和MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit的操作說(shuō)明，提取上述毒株核酸并放置于-80 ℃保存。

1.2.3CVA16 VP1基因擴(kuò)增和測(cè)序 采用One-step RT-PCR Kit對(duì)CVA16分離株VPl基因進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增引物序列分別為： CVA16-VP1-F: 5′-AGGTACTACACCCAGTGGTCAG-3′(2 030-2 052 nt), 和 CVA-VP1-R: 5′-GCAAGGTGCCGATTCACTACCCT-3′(3 400～3 423 nt)。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min, 95 ℃變性15 min, 95 ℃，30 s, 52 ℃，45 s, 72 ℃，90 s,35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。上述擴(kuò)增產(chǎn)物采用QIAxcel毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)驗(yàn)證后送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4生物信息學(xué)分析 采用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序獲得的CVA16 VP1序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列分析及同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)采用Mega 5.0軟件的最大似然法(Maximum Likelihood)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1發(fā)病概況 2009-2017年江蘇省共報(bào)告手足口臨床診斷病例1 013 771例，報(bào)告年均發(fā)病率為142.86/10萬(wàn)(1 013 771/ 709 615 095)，發(fā)病率最高為2014年的210.52 /10萬(wàn)，最低為2009年的109.35/10萬(wàn)；其中,重癥9 379例，年均重癥百分比為0.93%(9 379/ 1 013 771)；重癥百分比最高為2011年的1.78%，最低為2009年和2016年的0.42%，年重癥百分比呈下降趨勢(shì)。報(bào)告病例中男性構(gòu)成比59.27%～62.24%。自手足口病成為法定報(bào)告?zhèn)魅静∫詠?lái)，病例報(bào)告和監(jiān)測(cè)不斷完善和改進(jìn)，江蘇省手足口病報(bào)告趨于穩(wěn)定，2012年后出現(xiàn)偶數(shù)年份較奇數(shù)年份高發(fā)的特點(diǎn)，見(jiàn)表1。

2.2病原學(xué)檢測(cè) 2009-2017年江蘇省共檢測(cè)出手足口病腸道病毒(EV)陽(yáng)性病例37 389例。除2009年，其他年份每年檢出的腸道病毒陽(yáng)性病例均在3 600份以上，其中，EV71占39.85% (14 898/39 389)， CVA16占30.13%(11 265/37 389)，其他腸道病毒占28.88%(10 798/37 389)。2009-2017年，EV71在腸道病毒陽(yáng)性病例中的年度構(gòu)成比分別為45.14%、49.55%、50.66%、40.72%、35.96%、39.72%、15.03%、29.51%和47.26%，而CVA16在腸道病毒陽(yáng)性病例中的年度構(gòu)成比分別為40.34%、31.26%、29.15%、41.05%、11.97%、34.82%、29.46%、30.79%和21.34%，因此EV71和CVA16為占據(jù)主導(dǎo)地位的兩種血清型，如圖1所示。重癥病例中，主要以EV71血清型為主，在2009-2017年的重癥病例中，EV71的年度構(gòu)成比分別為85.49%、80.45%、80.06%、79.80%、67.74%、83.99%、94.72%、67.70%、86.18%，而CVA16的年度構(gòu)成比分別僅為4.15%、3.76%、8.16%、12.23%、1.34%、5.28%、0.77%、7.80%、3.92%，如圖2所示。

圖1 2009-2017年江蘇省手足口病病原構(gòu)成及腸道病毒陽(yáng)性病例數(shù)Fig.1 Enterovirus positive HFMD cases and distribution of enterovirus strains in Jiangsu province, 2009-2017

圖2 2009-2017年江蘇省手足口病重癥病原構(gòu)成及重癥病例數(shù)Fig.2 Enterovirus-associated severe HFMD cases and distribution of severe enterovirus strains in Jiangsu province, 2009-2017

2.3 CVA16流行病學(xué)特征

2.3.1人群分布 如圖3所示，2009-2017年江蘇省CVA16高發(fā)年齡段主要集中在6月齡～5歲，尤其是12-23月齡，小于6月齡，大于5歲和成年人發(fā)病率低。CVA16感染病例中男性構(gòu)成比介于55.97%～66.97%，其病例數(shù)年齡和性別分布與總體HFMD人群分布相近。

圖3 2009-2017年江蘇省CVA16發(fā)病年齡分布Fig.3 Age distribution of CVA16 cases in Jiangsu province, 2009-2017

2.3.2時(shí)間分布 如圖4所示，CVA16發(fā)病時(shí)間主要呈一主峰一次峰的雙峰流行，2009-2011年主峰發(fā)生在3-6月份，2012-2017年主峰發(fā)生在3-7月份；2010、2016和2017年無(wú)明顯次峰，其余年份次峰發(fā)生在9-11月，次峰遠(yuǎn)低于主峰。

圖4 2009-2017年江蘇省CVA16發(fā)病時(shí)間分布Fig.4 Distribution of CVA16 infection in Jiangsu province, 2009-2017

2.4VP1基因核苷酸及編碼氨基酸序列分析 對(duì)2009-2017年江蘇省104株CVA16型輕癥病例，16株CVA16重癥病例分離株進(jìn)行VP1基因核苷酸序列測(cè)定和分析。CVA16毒株VP1基因核苷酸序列長(zhǎng)度為891 bp, 編碼297個(gè)氨基酸。120株CVA16毒株VP1序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，104株CVA16輕癥GenBank登錄號(hào)為MH516915-MH517015, 16株CVA16重癥GenBank登錄號(hào)為：MH491122-MH491129, MH491131-MH491134和MA491136-491139。利用DNAStarMegAlign軟件進(jìn)行VP1基因核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析。120株CVA16毒株的核苷酸與氨基酸序列同源性分別為 87.5%～100%、 97%～100%。120株毒株的VP1基因與A基因型、B基因型各亞型B1a和B1b以及B2基因型VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 江蘇省CVA16分離株與CVA16不同基因性及亞型代表株VP1核苷酸與氨基酸同源性比較Tab.2 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among CVA16 strains from Jiangsu province and reference genotype (subgenotype) CVA16 strains based on VP1 genes

2.5江蘇省CVA16分離株VP1區(qū)編碼蛋白變異位點(diǎn)分析 將VP1完整編碼區(qū)翻譯成氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2009-2017年江蘇省的120株CVA16氨基酸序列的第23位點(diǎn)是氨基酸變異的頻繁區(qū)域，65株CVA16分離株發(fā)生了L→M的突變,其次是第218位點(diǎn)，7株CVA16分離株發(fā)生了N→G的突變。上述突變?cè)谳p癥和重癥病例中呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律散在分布。

2.6CVA16分離株VP1基因進(jìn)化分析 選取從GenBank下載的45條國(guó)內(nèi)其他省(市)和其他國(guó)家或地區(qū)有代表型的CVA16 VP1全長(zhǎng)序列，分別來(lái)自美國(guó)、馬來(lái)西亞、美國(guó)、越南、日本、泰國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家或地區(qū)以及我國(guó)大陸的山東、河南、湖南、廣東、浙江等省(市)[14-16]，與2009-2017年江蘇省的120條CVA16 VP1序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，2009-2017年120株CVA16江蘇分離株與B1a和B1b亞型代表株分別處于同一分支上(見(jiàn)圖5)，與原型株G-10及國(guó)外地區(qū)分離株的遺傳距離較遠(yuǎn)，與國(guó)內(nèi)地區(qū)(如河南、山東、浙江等省份)分離株的遺傳距離近，親緣關(guān)系近。120株CVA16江蘇分離株相互之間的遺傳距離較近，親緣關(guān)系近。同時(shí)，進(jìn)化樹(shù)顯示，江蘇省分離株在年度和各個(gè)地區(qū)分布上交錯(cuò)分布，無(wú)明顯聚集性，輕癥和重癥的毒株未在進(jìn)化樹(shù)上呈現(xiàn)規(guī)律分布。

A:CVA16分離株VP1區(qū)進(jìn)化樹(shù)分析； B:部分CVA16分離株VP1區(qū)進(jìn)化樹(shù)分析 ▲：輕癥 CVA16 分離株；●: 重癥 CVA16 分離株

3 討 論

本研究系統(tǒng)描述2009-2017年連續(xù)9年間江蘇省HFMD的發(fā)病情況和CVA16的病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果，為HFMD防控策略的制定及EV71疫苗上市后CVA16的流行趨勢(shì)和病原學(xué)變遷提供了詳細(xì)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

江蘇省是我國(guó)手足口病的流行區(qū)，2009-2012年江蘇省手足口病報(bào)告病例持續(xù)上升，2013年有所回落，之后呈現(xiàn)偶數(shù)年高發(fā)奇數(shù)年低發(fā)的流行特征，年均發(fā)病率為142.86/10萬(wàn)，年發(fā)病率總體呈上升趨勢(shì)。而重癥病例數(shù)自2015年后明顯下降，這可能與2016年EV71疫苗上市有關(guān)。

病原學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，江蘇省2009-2017年手足口病主要由EV71和CVA16引起，同時(shí)每年均伴隨其他腸道病毒的感染。EV71感染率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但2017年有所回升；CVA16總體感染率呈下降趨勢(shì)，其他腸道病毒感染率逐步上升。重癥病例中，年重癥百分比成下降趨勢(shì)，2009-2016年間每?jī)赡瓿霈F(xiàn)一次重癥高峰，但2017年的高峰并不明顯，這可能與人們對(duì)手足口病的重視以及EV71疫苗上市有關(guān)。病原方面重癥病例仍然以EV71為主要病原， CVA16及其他腸道病毒引起的重癥病例較少。而在2012年，CVA16引起的重癥病例數(shù)明顯增加，占12.23%，這可能與2012年EV71流行強(qiáng)度較小，而CVA16流行強(qiáng)度較高有關(guān)。之后CVA16引起的重癥病例數(shù)有所回落，2015年最低，為0.77%。2016年CVA16引起的重癥病例數(shù)再次增加。

對(duì)2009-2017年江蘇省CVA16感染病例進(jìn)行流行病學(xué)特點(diǎn)和病原學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行描述分析，其病例數(shù)年齡分布與總體HFMD年齡分布相近。CVA16易感人群是6個(gè)月～5歲嬰幼兒，尤其1～4歲組CVA16感染最高，與其他研究報(bào)道相似[17-18]，這可能與低年齡組免疫水平低下有關(guān)[19]。CVA16感染人群男性多于女性，這可能是男孩喜愛(ài)活動(dòng)，更多暴露在病毒環(huán)境中有關(guān)。

CVA16各年發(fā)病呈現(xiàn)兩個(gè)季節(jié)性高峰，2009-2011年主峰發(fā)生在3-6月份，2012-2017年主峰發(fā)生在3-7月；2010、2016和2017年無(wú)明顯次峰，其余年份次峰發(fā)生在9-11月，次峰遠(yuǎn)低于主峰。CVA16的時(shí)間分布特征與其它病原相似，但發(fā)病高峰時(shí)間較EV71 和其他腸道病毒提前一個(gè)月。由于3-6月氣溫逐漸回暖，降雨多，濕度大，有利于手足口病毒繁殖生存，易出現(xiàn)高發(fā)。隨著8月暑期放假，幼兒減少了在托幼機(jī)構(gòu)密切接觸機(jī)會(huì)，發(fā)病曲線出現(xiàn)明顯回落。9月開(kāi)學(xué)，學(xué)生返校，再次增加了接觸傳播的機(jī)會(huì)。12月至2月為全年最低氣溫期，發(fā)病率大幅降低。

對(duì)江蘇省120株CVA16型分離株進(jìn)行VP1基因核苷酸測(cè)定和分析，該120株CVA16毒株的VP1基因核苷酸與氨基酸序列同源性分別為87.5%～100%和 97%～100%。與A基因型和B基因型各亞型B1a、B1b以及B2株VP1區(qū)核苷酸同源性分別為74.1%～77.1%、88.3%～98.7%、88.1%～98.4%和87.1%～91.1%；氨基酸同源性分別為89.2%～92.3%、97.3%～100%、96.3%～100%和98.3%～100%。根據(jù)以上核苷酸和氨基酸序列同源性分析結(jié)果可知，CVA16分離株核苷酸序列變異較大，但氨基酸同源性較高，推斷存在一定的同義突變。對(duì)CVA16分離株VP1區(qū)氨基酸序列變異位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，第23位氨基酸位點(diǎn)為變異頻繁區(qū)域，有65株CVA16分離株發(fā)生了L→M的突變，其次是第218位點(diǎn)，有7株CVA16分離株發(fā)生了N→G的突變。上述突變?cè)谳p癥和重癥病例中呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律散在分布，提示上述突變位點(diǎn)與CVA16引起的臨床差異無(wú)關(guān)。

2009-2017年120株CVA16江蘇省分離毒株與原型株G-10株及國(guó)外地區(qū)分離株遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系遠(yuǎn)，與國(guó)內(nèi)地區(qū)分離株的遺傳距離近，親緣關(guān)系近。提示江蘇省CVA16分離株在進(jìn)化上并不是獨(dú)立的，而是與國(guó)內(nèi)地區(qū)的CVA16同進(jìn)化共循環(huán)的。VP1基因序列的進(jìn)化分析顯示，引起江蘇省HFMD的120株CVA16分屬于B1a亞型和B1b亞型，其中B1b亞型為優(yōu)勢(shì)流行基因亞型。推測(cè)進(jìn)化樹(shù)上這兩簇的形成可能與其進(jìn)化來(lái)源有關(guān)。輕癥,重癥在進(jìn)化樹(shù)上無(wú)規(guī)律散在分布，提示CVA16引起的臨床差異可能與VP1區(qū)的基因序列無(wú)關(guān)。

本研究通過(guò)對(duì)2009-2017年江蘇省HFMD流行情況和CVA16的分子流行病學(xué)特征及其基因特征進(jìn)行分析。對(duì)疫苗使用前后江蘇省CVA16的流行趨勢(shì)和病原學(xué)變遷進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，為本省HFMD的有效防控提供基礎(chǔ)資料。

利益沖突：無(wú)