當(dāng)歸補(bǔ)血湯對宮頸癌荷瘤小鼠抑瘤效果及對免疫調(diào)節(jié)作用的研究*

聶金霞，陳 難，鄧克紅

1.鄭州市婦幼保健院產(chǎn)科(鄭州 450000);2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(鄭州 450014)

宮頸癌是發(fā)生于子宮頸陰道部或移行帶的鱗狀上皮細(xì)胞與頸管內(nèi)膜的惡性腫瘤，在全球婦女癌癥死亡率中居第二，每年全球約50萬新増病例，它嚴(yán)重威脅女性健康[1-2]。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)從量變到質(zhì)變的過程。在移行帶形成過程中，宮頸上皮化生過度活躍，加之在HPV等外來物質(zhì)的刺激下，鱗狀上皮未成熟化生或增生出現(xiàn)間變性或不典型增生，形成宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)。隨著CIN的發(fā)展，突破上皮下基底膜并浸潤間質(zhì)形成宮頸浸潤癌?，F(xiàn)階段宮頸癌的治療主要包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療等方法，手術(shù)療法因術(shù)后應(yīng)激或是手術(shù)損傷導(dǎo)致并發(fā)癥，尤其是術(shù)后仍要放化療的，術(shù)后恢復(fù)效果緩慢，放射治療可能出現(xiàn)皮膚、胃腸道等副反應(yīng)，化學(xué)治療出現(xiàn)白細(xì)胞下降、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)等[3-5]。有報(bào)道[6-7]指出中醫(yī)藥作為一種輔助治療手段同西醫(yī)治療手段配合有助于提高癌癥的治療效果。目前單純用中醫(yī)藥治療宮頸癌并不現(xiàn)實(shí)，但作為輔助治療可大大提高臨床療效。中醫(yī)治療宮頸癌不僅可以降低HPV感染，還具有一定的抗腫瘤作用。中西醫(yī)結(jié)合治療宮頸癌可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，改善臨床癥狀，促進(jìn)術(shù)后康復(fù)，降低可能的手術(shù)副作用，促進(jìn)其康復(fù)，并且能夠減少放化療副作用，提高患者對放化療的耐受性，增加患者對放療的敏感性，增強(qiáng)手術(shù)前后機(jī)體的抗感染能力，大大提高臨床療效[8]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯起源于金元時(shí)期《內(nèi)外傷辨惑論》，由炙黃芪、當(dāng)歸組成[6]。它是治療血虛的名方，主要治療疲勞、內(nèi)傷、氣血虛弱、婦女月經(jīng)、產(chǎn)后血虛熱、頭痛、酸痛、潰瘍等。研究表明[9-11]，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成。同時(shí)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可顯著提高腫瘤患者的生活質(zhì)量、Karnofsky評分、癥狀緩解等?；A(chǔ)研究還表明[12-13]，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能延緩腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間。但當(dāng)歸補(bǔ)血湯對宮頸癌的作用機(jī)制尚未清楚，本研究從荷瘤小鼠模型入手，分析當(dāng)歸補(bǔ)血湯對宮頸癌荷瘤小鼠抑瘤效果及免疫調(diào)節(jié)作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：8周雌性Balb/c小鼠40只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，用于抑瘤效果研究)，6周雌性Balb/c小鼠40只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，用于小鼠免疫調(diào)節(jié)研究)；小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液等；二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、顯微鏡等。

1.2 免疫抑制的建立：首先對所有Balb/c小鼠腹腔注射環(huán)憐酣胺100 mg/(kg·d)，隔日1次，共射5次，分別對注射前、注射后2、4、6、8、10 d鼠尾采血行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，正常小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)在(4～12)×109/L，當(dāng)小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低至3×109/L以下時(shí)，表明小鼠免疫抑制模型建立成功。所有小鼠在首次注射環(huán)磷酰胺后第4、6、8、10 d后，白細(xì)胞計(jì)數(shù)均達(dá)到3×109/L以下，分別為(2.73±0.36)109/L、(2.59±0.28)109/L、(2.39±0.36)109/L、(2.26±0.27)109/L，所有小鼠免疫抑制建模成功。

1.3 宮頸癌荷瘤小鼠模型建立：常規(guī)復(fù)蘇傳代小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株，當(dāng)Hela細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底部面積約89%～90%時(shí)，將原瓶中的培養(yǎng)液倒掉，用PBS緩沖液沖洗3次，然后加入適量胰蛋白酶液消化Hela細(xì)胞，待原本貼壁生長的細(xì)胞變圓漂浮后加入1640(+)胎牛血清混合培養(yǎng)基暫停消化，離心棄上清，懸浮沉淀，計(jì)數(shù)定容。皮下種植法將細(xì)胞懸液植入小鼠，建立荷瘤小鼠模型(雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)皮下分別接種細(xì)胞懸液0.2 ml/次，腫瘤長至5 mm×5 mm×5 mm左右表示建模成功。

2 研究方法

2.1 抑瘤分組：將成功建模的8周齡宮頸癌荷瘤小鼠分成兩組，每組20只，A組給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯0.5 ml/只，1次/d，B組給與等量的蒸餾水灌胃，兩組小鼠均在spf級環(huán)境下喂養(yǎng)，每周更換飼料、墊料，實(shí)驗(yàn)周期為12周。對兩組喂藥前、喂藥后4周、8周、12周腫瘤體積進(jìn)行測量，計(jì)算腫瘤生長率。免疫調(diào)節(jié)分組：將成功建模6周Balb/c宮頸癌荷瘤小鼠分成兩組，每組20只，C組給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯0.5 ml/只，1次/d，D組給予等量的蒸餾水灌胃，兩組小鼠均在SPF級環(huán)境下喂養(yǎng)，每周更換飼料、墊料，持續(xù)2周，斷頸處理，剖去胸腺、脾臟，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾腺指數(shù)。

2.2 觀察指標(biāo)：根據(jù)腫瘤組織大小計(jì)算腫瘤體積：長徑×短徑×縱徑。腫瘤生長率=(腫瘤體積n+1月/腫瘤體積n月)×100%。胸腺指數(shù)=胸腺重量/去瘤體重；脾腺指數(shù)=脾腺重量/去瘤體重。

結(jié) 果

1 小鼠生存狀態(tài)變化 喂藥結(jié)束后，A組存活10只，B組存活3只，對照喂藥前后兩組小鼠的體重、生存時(shí)間級綜合評分對比發(fā)現(xiàn)，A組與B組相比，體重較B組明顯增加，生存時(shí)間明顯延長，根據(jù)生存狀態(tài)評分兩組綜合評分具有明顯差異(P<0.05)，具體見表1。

2 抑瘤效果評價(jià) A組用藥4周、8周、12周后腫瘤體積均明顯小于B組(P<0.01)，A組用藥4周、8周后腫瘤生長率明顯低于B組(P<0.01)，用藥12周后腫瘤生長率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體見表2。

表1 兩組荷瘤小鼠生存狀態(tài)情況及評分

表2 兩組宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤生長情況(n=20)

3 免疫調(diào)節(jié)作用評價(jià) 停藥斷頸處死小鼠，剖取胸腺、脾臟稱重，計(jì)算出胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。C組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著高于D組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，具體見表3。

表3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對宮頸癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)影響(mg/g)

討 論

目前，宮頸癌的主要治療手段包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療等，中醫(yī)認(rèn)為宮頸癌病因是邪盛正虛，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)[14-15]，由于正氣虛衰，濕熱毒邪內(nèi)侵，致臟腑失調(diào)、氣血失常，瘀血、濕毒等相繼內(nèi)生，留滯積聚不解，日久漸成癌腫。中藥治療宮頸癌的作用機(jī)理研究主要有以下幾種：保護(hù)或提高機(jī)體免疫功能：通過能夠激活機(jī)體免疫細(xì)胞的中藥，促進(jìn)細(xì)胞因子的生成，來調(diào)節(jié)抗體和補(bǔ)體的生成，以達(dá)到保護(hù)或者增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡。中西醫(yī)治療宮頸癌能夠有效祛除HPV感染和抗腫瘤作用，中醫(yī)認(rèn)為治療的關(guān)鍵在于扶正祛邪 ，通過扶正來改善免疫狀態(tài)，增強(qiáng)對惡性刺激抵抗力，促進(jìn)術(shù)后恢復(fù)，改善副作用，提高對放化療的耐受程度，減輕放化療毒副作用；通過祛邪來抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡達(dá)到抗癌抑癌效果，促進(jìn)康復(fù)[16-17]。 國內(nèi)外研究[18-19]指出機(jī)體免疫應(yīng)答能力同腫瘤發(fā)展有密切聯(lián)系，免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞生長能力有限制能力，胸腺和胰腺均是機(jī)體重要免疫器官，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)能夠較好的反應(yīng)機(jī)體免疫功能[20]。本研究對當(dāng)歸補(bǔ)血湯在宮頸癌荷瘤小鼠的抑瘤效果和免疫調(diào)節(jié)功能的影響進(jìn)行分析。當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之效，主要成分是當(dāng)歸和黃芪，當(dāng)歸可補(bǔ)血活血，國外研究[21-22]中對當(dāng)歸多糖的作用進(jìn)行研究，指出當(dāng)歸多糖是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，能夠增強(qiáng)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。黃芪主要可以改善血液循環(huán)，作用后可激活抗氧化解毒酶，消除超氧離子，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究顯示，喂藥結(jié)束后，A組存活10只，B組存活3只，并且當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠明顯延長宮頸癌荷瘤小鼠的平均生存天數(shù)，經(jīng)過灌喂后，當(dāng)歸補(bǔ)血湯組小鼠的平均體重明顯高于灌喂蒸餾水組，并且生存評分明顯高于B組，說明中藥當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠明顯改善宮頸癌荷瘤小鼠的生存情況。本文中A組宮頸癌荷瘤小鼠服用當(dāng)歸補(bǔ)血湯后的腫瘤體積和腫瘤生長率均明顯低于B組，說明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對腫瘤有較好的抑制作用，治療后12周A組與B組生長率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)?2周后兩組剩余生存小鼠比較少，樣本量不足，造成的與B組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此該實(shí)驗(yàn)僅能說明早期應(yīng)用當(dāng)歸補(bǔ)血湯有明顯的減緩宮頸癌瘤體生長速度。陳雪霽等[10]討論對箬葉多糖對移植性乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)箬葉多糖對腫瘤的抑制效果顯著，通過調(diào)節(jié)免疫功能抑制腫瘤的生長。上述研究和本文結(jié)果提示中醫(yī)藥成分在腫瘤治療中發(fā)揮良好的輔助作用。從免疫調(diào)節(jié)作用分析來看，C組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯高于D組，服用當(dāng)歸補(bǔ)血湯后的主要作用是要通過對機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)來抑制腫瘤生長，從而達(dá)到延長生存期，提高康復(fù)效果。宋磊等[23]對樺褐孔菌醇提取物對MFC胃癌荷瘤小鼠抑瘤作用及免疫調(diào)節(jié)的初步探討，認(rèn)為中醫(yī)藥具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤生長的作用。當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的黃芪通過抑制T細(xì)胞，促使其他T細(xì)胞亞群免疫功能增強(qiáng)，保護(hù)T細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，從脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)可以看出，該中藥成分對免疫功能調(diào)節(jié)作用是明顯的，從而提高了抑制腫瘤生長的效果。國內(nèi)外的一些報(bào)道[24]對多糖類藥物的抗腫瘤作用進(jìn)行分析，認(rèn)為多糖類藥物的抗腫瘤效果同免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，多糖能顯著激活單核細(xì)胞，促進(jìn)免疫因子釋放，抑制腫瘤。

綜上所述，當(dāng)歸補(bǔ)血湯對宮頸癌荷瘤小鼠抑瘤效果明顯，減緩瘤體的生長速度，有效延長荷瘤小鼠的生存期，減少死亡，對免疫狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用。因此，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以作為一項(xiàng)補(bǔ)充治療用于宮頸癌治療。