siRNA靶向抑制SPAG9對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及JNK信號(hào)通路的影響

羅書(shū)笛 任碧瓊 劉俊龍 陳 維

肝癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)生率位居世界第5位，病死率位居第3位。據(jù)2015癌癥研究報(bào)告報(bào)道，全世界每年有748300例新增肝癌，中國(guó)占50%[1]。由于肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)瘤體體積較大，并伴隨微血管侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差[2]。因此，有必要探索腫瘤相關(guān)分子在肝癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)鍵環(huán)節(jié)中的作用，尋找靶向治療靶點(diǎn)，為臨床肝癌的早期診斷與治療提供新的手段。

精子相關(guān)抗原9(sperm associated antigen 9，SPAG9) 屬于癌睪丸抗原家族，定位于人類(lèi)染色體17q21.33的單拷貝基因。人類(lèi)SPAG9由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，兩個(gè)卷曲螺旋，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及JNK結(jié)合結(jié)構(gòu)域(JNK binding domain，JBD)。SPAG9正常在睪丸組織中表達(dá)，定位表達(dá)于精子頂體的赤道板區(qū)域，在受精過(guò)程中發(fā)揮重要作用；當(dāng)異位表達(dá)于腫瘤組織中時(shí)，會(huì)誘發(fā)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，有望作為腫瘤早期診斷的血清標(biāo)志物[3,4]。研究表明，SPAG9在乳腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤中存在過(guò)表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后有關(guān)[5～10]。

目前，SPAG9在肝癌中的表達(dá)及其調(diào)控肝癌生物學(xué)行為的研究尚不多見(jiàn)。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，與L02正常肝細(xì)胞株比較，SPAG9在QGY7703、HepG2、Bel-7402、Hep3B等多種肝癌細(xì)胞株中均高表達(dá)，并研究了SPAG9對(duì)QGY7703細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SPAG9對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，本研究探究SPAG9在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)模式，并觀察采用siRNA敲低SPAG9后對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展的影響。

材料與方法

1.材料：人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青/鏈霉素、PBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。靶向人源性SPAG9小干擾RNA(SPAG9siRNA)和control siRNA由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成?？筍PAG9單克隆抗體(ab12331)、抗JNK單克隆抗體(ab179461)、驢抗兔熒光二抗(ab150073)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,抗GAPDH抗體(LC A04)購(gòu)自艾佳生物(Auragene)公司。CCK8試劑盒購(gòu)自日本Dojndo公司。

2.方法：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞HepG2在含10%胎牛血清、1% 雙抗的RPMI-1640的完全培養(yǎng)基中，于37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。每2～3天用0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶2傳代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞雙色免疫熒光實(shí)驗(yàn)：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞HepG2接種于細(xì)胞爬片上，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將制作好的HepG2細(xì)胞爬片置于4%多聚甲醛中固定20min，Triton-X100通透3min，5% BSA封閉1h，抗SPAG9抗體(1∶50)4℃孵育過(guò)夜。次日，PBS清洗3遍，驢抗兔-FITC熒光二抗(綠色)37℃孵育1h，PBS清洗3遍，DAPI染液(藍(lán)色)染細(xì)胞核10min，PBS清洗3遍，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。(3)siRNA轉(zhuǎn)染：siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照siRNA組和SPAG9siRNA組。siRNA轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板上，密度為5×104個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)至細(xì)胞50%～60%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。PBS清洗細(xì)胞3遍后，每孔加入1.5ml無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，采用Lipofectamine 2000每孔轉(zhuǎn)染2μg質(zhì)粒。(4)CCK8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板上，密度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染SPAG9siRNA，同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h后，棄去96孔板中的舊培養(yǎng)基，PBS清洗后加入新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)每孔加入10μl CCK8溶液，混勻，37℃避光孵育2h后，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值(A值)。(5)流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)：胰酶消化收集腫瘤細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，每次2000r/min離心5min，收集約(1～5)×105細(xì)胞；加入500μl的Binding buffer 懸浮細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻；室溫、避光，反應(yīng)5～15min，1h內(nèi)，在流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)。(6)流式細(xì)胞周期檢測(cè)：消化收集細(xì)胞沉淀，800r/min，離心5min，棄上清；加入1ml 預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，800r/min離心5min，離心收集細(xì)胞；重復(fù)1～2次，去除乙醇；加入150μl PI(碘化丙啶)工作液，4℃ 避光染色30min；轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，上機(jī)檢測(cè)，PI用488nm氬離子激光器激發(fā)，由630nm通濾光片接收，通過(guò)FSC/SSC 散點(diǎn)圖收集10000個(gè)細(xì)胞，采用設(shè)門(mén)技術(shù)，排除粘連細(xì)胞和碎片，分析PI熒光直方圖上各細(xì)胞周期的百分率。(7)Western blot法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：肝癌細(xì)胞HepG2轉(zhuǎn)染SPAG9siRNA 24h后收集細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解20min，4℃ 10000r/min離心10min,取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，-20℃保存。配置8% SDS-PAGE膠，蛋白上樣量為30μg常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，4℃孵育SPAG9(1∶1000)、GAPDH(1∶3000)一抗過(guò)夜；二抗(1∶4000)孵育1h。PBST(含0.1% Tween-20的PBS溶液)洗膜3次,每次15min。ECL發(fā)光液與膜孵育3min后，暗室顯影曝光。

結(jié) 果

1.SPAG9在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)：細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照細(xì)胞平均吸光度值為0，實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞熒光平均吸光度(A)值為0.602±0.031，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.334,P=0.012)，定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中(圖1)。

圖1 細(xì)胞雙色免疫熒光檢測(cè)SPAG9在肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá)及定位(×200)綠色熒光為FITC標(biāo)記的SPAG9蛋白，藍(lán)色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核

2.SPAG9siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞SPAG9及JNK蛋白表達(dá)水平的影響：Western blot法分別檢測(cè)SPAG9siRNA組(HepG2i)和對(duì)照組(HepG2)SPAG9蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示SPAG9siRNA組SPAG9蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P=0.001)，SPAG9siRNA組JNK蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P=0.302，圖2)。

圖2 Western blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞SPAG9及JNK的表達(dá)A.轉(zhuǎn)染SPAG9 siRNA前后SPAG9的表達(dá)；B.轉(zhuǎn)染SPAG9 siRNA前后JNK的表達(dá)；C.SPAG9和JNK蛋白灰度分析柱狀圖。*P<0.05，**P<0.01，n=3

3.SPAG9siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響：CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染SPAG9siRNA 24h及48h后HepG2細(xì)胞的增殖能力均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均為0.000，表1，圖3)。

表1 CCK8增殖結(jié)果分析

*P<0.01

圖3 SPAG9 siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖能力的影響*P<0.01(n=3)

4.SPAG9siRNA干擾對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SPAG9siRNA組的細(xì)胞周期G1期細(xì)胞顯著減少(t=28.578，P=0.000)，S期細(xì)胞顯著增多(t=-26.658，P=0.004)，細(xì)胞周期阻滯于S期(表2，圖4)。

表2 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期檢測(cè) (%)

*P<0.05,**P<0.01

圖4 SPAG9 siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響A.轉(zhuǎn)染SPAG9 siRNA前后流式細(xì)胞周期檢測(cè)圖；B.轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞周期分析柱狀圖；*P<0.01，n=3

5.SPAG9siRNA干擾對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染SPAG9siRNA前后HepG2細(xì)胞凋亡率的變化，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，SPAG9siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著增加(t=-14.275，P=0.003，表3，圖5)。

表3 流式細(xì)胞術(shù)凋亡率檢測(cè) (%)

*P<0.01

圖5 SPAG9 siRNA對(duì)肝癌凋亡的影響A.轉(zhuǎn)染SPAG9 siRNA前后流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖，HepG2為未轉(zhuǎn)染組，HepG2i為轉(zhuǎn)染組；B.轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞凋亡率分析柱狀圖;*P<0.01,n=3

討 論

癌睪丸抗原(cancer-testis antigen CTA)主要表達(dá)于正常生殖組織，例如胎盤(pán)，卵巢和睪丸，在分化組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)，在多種人類(lèi)腫瘤中異常表達(dá)，這種異常表達(dá)可以解釋為“重新表達(dá)”，并可作為癌源性細(xì)胞的標(biāo)記[11～13]。SPAG9是CTA家族的新成員，與其他CTA不同的是，SPAG9具有較強(qiáng)的免疫原性，能引起機(jī)體體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生自身抗體[14]。文獻(xiàn)報(bào)道，SPAG9在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤的分期分級(jí)相關(guān)，惡性腫瘤患者體內(nèi)SPAG9的表達(dá)水平顯著高于良性腫瘤患者，且早期腫瘤患者癌組織中SPAG9蛋白表達(dá)與血清中SPAG9抗體水平有相關(guān)性[15,16]。因此，SPAG9抗體有望作為腫瘤標(biāo)志物為腫瘤的早期診斷提供參考。

關(guān)于SPAG9表達(dá)的定位，大多數(shù)研究報(bào)道主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)[16,17]。然而，筆者的細(xì)胞免疫熒光研究結(jié)果顯示，SPAG9不僅在HepG2細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞核中也有表達(dá)。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制肝癌QGY-7703細(xì)胞中SPAG9蛋白的表達(dá)，能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)特異性抑制HepG2細(xì)胞中SPAG9的表達(dá)后，HepG2細(xì)胞的增殖率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加。這一結(jié)果與肝癌QGY-7703細(xì)胞的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明SPAG9在腫瘤的形成及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中SPAG9蛋白的表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期[17]。本研究抑制肝癌HepG2細(xì)胞中SPAG9蛋白的表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯于S期，說(shuō)明在不同的肝癌細(xì)胞株中，SPAG9促進(jìn)肝癌細(xì)胞進(jìn)程的機(jī)制可能存在差異，具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

JNK信號(hào)通路是MAPK通路中的一個(gè)重要分支，在細(xì)胞周期、增殖、凋亡及應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。支架蛋白的功能主要是為三級(jí)激酶模塊的聚集提供物理結(jié)構(gòu)，例如JNK、ERK和p38MAPKs。從結(jié)構(gòu)上看，SPAG9作為支架蛋白，其JBD結(jié)構(gòu)域能夠與JNK蛋白相互作用，調(diào)控JNK信號(hào)通路的活化。研究顯示，在星狀細(xì)胞瘤中，抑制SPAG9蛋白的表達(dá)會(huì)下調(diào)JNK、p-JNK及JunD的表達(dá)，JunD能夠通過(guò)上調(diào)cyclinD1、MMP7和MMP9蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖，由此得出，SPAG9促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移可能是通過(guò)JNK-JunD信號(hào)通路[15]。采用siRNA干擾技術(shù)將SPAG9siRNA轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制SPAG9蛋白的表達(dá)后，JNK的表達(dá)量也隨之降低，因此推測(cè)，SPAG9能夠上調(diào)JNK蛋白的表達(dá)，從而激活JNK信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起調(diào)控作用。

綜上所述，SPAG9在肝癌的形成及發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用與JNK信號(hào)通路激活有關(guān)，而JNK信號(hào)通路主要是調(diào)控細(xì)胞的增殖、周期及凋亡等生理過(guò)程，因此，可以通過(guò)抑制SPAG9來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞JNK信號(hào)的活化，調(diào)控腫瘤的形成及發(fā)展，SPAG9有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。