豁痰化瘀利水方對(duì)急性硬膜下血腫大鼠腦組織MCP-1、NF-κB的影響

蔡清風(fēng) 劉正敏 李 燁 胡小銘 劉補(bǔ)興 童軍衛(wèi)

急性硬膜下血腫(acute subdural hematoma，ASDH)是由于大腦橋靜脈斷裂使得血液聚集于硬膜下腔而形成的一種顱腦損傷并發(fā)癥，患者臨床常出現(xiàn)顱內(nèi)高壓、腦水腫而表現(xiàn)為失語(yǔ)、偏癱、昏迷等癥狀，其致殘率高、病死率高，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)高壓、腦水腫多由非感染性炎性反應(yīng)引起，而單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、核因子-κB(NF-κB)在炎癥發(fā)生過(guò)程中起著重要作用[2，3]。目前，臨床多通過(guò)手術(shù)治療ASDH患者，但手術(shù)病死率居高不下[4]。研究顯示，中醫(yī)藥治療ASDH能有效降低炎性反應(yīng)，療效顯著[5]。由此，本研究通過(guò)建立成年大鼠ASDH模型，以探究分析豁痰化瘀利水方對(duì)ASDH大鼠腦組織MCP-1、NF-κB的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1.材料與試劑：所有健康成年SD大鼠由筆者醫(yī)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2016-0019；豁痰化瘀利水方各中藥成分均購(gòu)自臺(tái)州中醫(yī)大藥房；天丹通絡(luò)膠囊(規(guī)格0.4克/粒；批號(hào)：20150204)購(gòu)自山東鳳凰制藥股份有限公司；DAB顯色試劑盒(規(guī)格：100ml，批號(hào)：DA1015)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；羊抗大鼠MCP-1(批號(hào)：sc-130328)及兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Trizol一步法試劑盒及RT-PCR定量引物均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒及相關(guān)酶類均購(gòu)自日本TaKaRa公司；免疫印跡ECL發(fā)光試劑盒(規(guī)格：100ml，批號(hào)：E002050)購(gòu)自上海碩嘉生物科技有限公司。

2.動(dòng)物處理及分組：選取健康成年SD大鼠152只，雌雄各半，3月齡，體質(zhì)量250±20g，按數(shù)字表法將其隨機(jī)分為4組，每組各38只；(1)模型組：即ASDH組，鉆孔注血，以灌胃方式給予該組2ml蒸餾水。(2)假手術(shù)組：即Sham組，只鉆孔不注血，以灌胃方式給予該組2ml蒸餾水。(3)陽(yáng)性對(duì)照組：以灌胃方式給予ASDH大鼠2ml天丹通絡(luò)膠囊治療，0.54g/kg，1次/天。(4)觀察組：以灌胃方式該組給予ASDH大鼠2ml豁痰化瘀利水方低劑量、中劑量、高劑量治療，濃度分別為14.13、28.26、56.52g/kg，1次/天；以上處理均持續(xù)14天。

3.藥物制備：豁痰化瘀利水方由20g丹參、15g當(dāng)歸、15g川芍、15g水蛭、15g地龍、10g膽南星、6g天竺黃等中藥材組成，加水600ml，室溫浸泡30min，常規(guī)煎煮至200ml，過(guò)濾藥液后并在藥渣中重新加水300ml，常規(guī)煎煮至200ml，經(jīng)再次過(guò)濾后棄渣保留濾液，合并2次過(guò)濾藥液，將其加熱濃縮，后續(xù)分別將其濃度稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。將天丹通絡(luò)膠囊藥物活性成分研磨后溶于水中。

4.ASDH造模：依據(jù)Yokobori等[6]的造模方法，并稍加改良以復(fù)制ASDH模型，具體操作如下：所有SD大鼠均給予3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后SD大鼠取俯臥位并將其頭部固定于腦立體定向儀上，頭部剃毛后給予常規(guī)消毒，沿頭頂部正中線切開(kāi)1個(gè)長(zhǎng)約0.5cm的切口，偏右側(cè)剝離骨膜以露出矢狀縫與冠狀縫，采用楔形高速鉆頭在矢狀縫右側(cè)3mm及冠狀縫后側(cè)2mm處開(kāi)1個(gè)直徑0.9mm的骨窗孔(注意避免破壞硬膜)，取自體股靜脈血500μl通過(guò)骨窗孔以50μl/s的速度注入硬膜下腔隙(注意避免破壞蛛網(wǎng)膜)，待血液凝固后拔出針頭，封閉骨窗孔并縫合頭皮，連續(xù)3天注射青霉素以防止感染，通過(guò)剝離腦組織觀察注血側(cè)血腫情況已證實(shí)ASDH造模成功。

5.ASDH模型腦組織血腫觀察：處理14天后，每組隨機(jī)取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，迅速剝離腦組織觀察各組血腫大小，以ASDH造模后第3天大鼠腦組織血腫面積為對(duì)照1(即100%)，分析各組處理后急性硬膜下血腫消散情況。

6.腦組織免疫組化分析：處理14天后，每組隨機(jī)取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，取注血側(cè)腦組織于液氮中冷凍10s，之后用冰凍組織切片包埋劑(OTC)包埋腦組織，通過(guò)冰凍切片機(jī)獲得4μm厚的冠狀位連續(xù)切片，將腦組織切片置于10%甲醛溶液于4℃下固定過(guò)夜，經(jīng)脫蠟、脫水等處理后，可通過(guò)DAB顯色試劑盒進(jìn)行MCP-1、NF-κB免疫組織化學(xué)染色。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為棕黃色，在光學(xué)顯微鏡下每只大鼠腦切片隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)視野(放大倍數(shù)×400)，依據(jù)視野中陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比例表示該切片MCP-1、NF-κB的表達(dá)情況。

7.腦組織MCP-1及NF-κB mRNA水平檢測(cè)：處理14天后，每組隨機(jī)取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，取注血側(cè)腦組織100mg，采用Trizol一步法試劑盒提取大鼠腦組織總RNA，保證總RNA的濃度、純度及完整性，通過(guò)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取模板cDNA，將模板稀釋至100ng/μl，采用RT-PCR試劑盒分別以MCP-1、NF-κB及內(nèi)參基因β-actin定量引物(引物序列見(jiàn)表1)，在RT-PCR儀上(廠家：Bio-Rad；型號(hào)：CFX96)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；55℃退火25s；72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。數(shù)據(jù)讀取由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)完成，供試基因的擴(kuò)增效率均在85%以上?；騇CP-1、NF-κB及β-actin表達(dá)水平計(jì)算采用2-ΔΔCt方法，詳見(jiàn)表1。

8. 腦組織MCP-1及NF-κB蛋白水平檢測(cè)：處理14天后，每組隨機(jī)取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，從注血側(cè)腦組織中提取總蛋白。將腦組織用1×PBS緩沖液漂洗2次，之后置于含1mmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液中進(jìn)行勻漿，經(jīng)低溫離心機(jī)以12000r/min轉(zhuǎn)速離心10min后分離上清液，加入2×PBS上樣緩沖液，經(jīng)沸水浴變性10min，通過(guò)10%的SD-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉于4℃下封閉1h，并用一抗兔抗大鼠MCP-1、NF-κB及β-Actin多克隆抗體以1∶500比例于4℃下孵育過(guò)夜，之后再將HPP結(jié)合的二抗以1∶5000比例與膜于室溫下孵育1h，通過(guò)免疫印跡ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織MCP-1、NF-κB蛋白表達(dá)水平。

表1 基因MCP-1及NF-κB引物序列

結(jié) 果

1.急性硬膜下血腫消散情況比較：與ASDH模型組比較，其余各組血腫面積均顯著降低，詳見(jiàn)表2。低劑量組大鼠腦組織血腫消散改善情況低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，中、高劑量組均高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，且高劑量組顯著高于中劑量組(P<0.01)。對(duì)各腦組織組血腫面積定量分析發(fā)現(xiàn)，與ASDH模型組比較，各組血腫面積均顯著降低(P<0.01)，詳見(jiàn)圖1、圖2；低劑量組明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組

表2 不同組急性硬膜下血腫面積比較

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P<0.01；與低劑量組比較，ΔP<0.01；與中劑量組比較，▲P<0.01

(P<0.01)，中、高劑量組血腫面積顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)，且高劑量組低于中劑量組(P<0.01)，詳見(jiàn)圖3。

圖1 不同組急性硬膜下血腫消散情況

圖2 不同組血腫消散情況

圖3 不同組血腫面積比較與ASDH模型組比較，*P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P<0.01；與低劑量組比較，ΔP<0.01；與中劑量組比較，▲P<0.01

2.免疫組化分析：各組中均觀察到腦組織細(xì)胞質(zhì)中MCP-1、NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)，Sham組MCP-1、NF-κB蛋白有弱陽(yáng)性表達(dá)，而ASDH模型組MCP-1、NF-κB蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，詳見(jiàn)表3、圖4及圖6。與ASDH模型組比較，其他組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均顯著降低(P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，觀察組中劑量、高劑量組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而低劑量組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與中劑量比較，高劑量組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著降低(P<0.01)，詳見(jiàn)表3、圖5及圖7。

表3 不同組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況比較

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量比較，&P<0.01

圖4 MCP-1蛋白表達(dá)染色情況

圖5 MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比例與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖6 NF-κB蛋白表達(dá)染色情況

圖7 NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比例與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

3.MCP-1及NF-κB mRNA水平：各組總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳圖，詳見(jiàn)圖8；與ASDH模型組比較，其他組MCP-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中劑量、高劑量組MCP-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，低劑量組水平均顯著升高(P<0.01)；與中劑量比較，高劑量組MCP-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，詳見(jiàn)表4、圖9及圖10。

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖8 各組總RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖9 MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，以ASDH模型表達(dá)水平為對(duì)照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖10 NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平，以ASDH模型表達(dá)水平為對(duì)照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

4.MCP-1及NF-κB蛋白水平：各組蛋白電泳圖見(jiàn)圖11。與ASDH模型組比較，其他組MCP-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中、高劑量組MCP-1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，而低劑量組均顯著升高(P<0.01)；與中劑量比較，高劑量組MCP-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，詳見(jiàn)表5、圖12及13。

表5 不同組MCP-1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖11 MCP-1、NF-κB蛋白免疫印跡電泳條帶

圖12 MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin內(nèi)參蛋白為對(duì)照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖13 NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin內(nèi)參蛋白為對(duì)照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

討 論

本研究基于Yokobori等[6]的造模方法并加以改良后獲得了穩(wěn)定、高效的大鼠急性硬膜下血腫模型(ASDH)，通過(guò)剝離腦組織觀察注血側(cè)血腫情況已證實(shí)ASDH造模成功。為確定正常情況及治療處理后血腫消散情況，本研究分析統(tǒng)計(jì)各組血腫面積，結(jié)果表明正常情況下ASDH模型14天后存在部分血腫自然消散情況，而其他組血腫面積均顯著低于ASDH模型組；處理后觀察組中劑量及高劑量組血腫面積均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組，而觀察組低劑量組血腫面積顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組，提示豁痰化瘀利水方具有促進(jìn)血腦屏障恢復(fù)，減輕腦水腫的作用，且與劑量有關(guān)，劑量越高其效果越顯著。

有關(guān)研究表明，急性硬膜下血腫發(fā)生后，其血腫周圍組織可刺激誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子聚集，并引發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)，進(jìn)而加劇腦損傷[7，8]。MCP-1屬于CC趨化因子家族，是一種促炎細(xì)胞因子，可在神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的神經(jīng)組織中表達(dá)，腦血腫損傷能夠特異性激活并趨化單核-吞噬細(xì)胞參與炎性反應(yīng)，而活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量神經(jīng)毒性因子，在腦損傷、神經(jīng)炎癥等多種疾病中具有重要作用[9，10]；MCP-1可通過(guò)單核-吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)誘導(dǎo)釋放炎性細(xì)胞因子及在腦損傷區(qū)域聚集白細(xì)胞而加劇血腫炎性反應(yīng)[11]。研究顯示，ASDH等疾病發(fā)生時(shí)MCP-1水平呈高表達(dá)，病情好轉(zhuǎn)時(shí)，MCP-水平顯著降低[12]。本研究結(jié)果表明，與ASDH模型組比較，其他組血腫面積、MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比例、mRNA相對(duì)表達(dá)水平及蛋白水平均顯著降低，且效果與豁痰化瘀利水方劑量呈依賴關(guān)系，認(rèn)為豁痰化瘀利水方更能有效減少硬膜下血腫面積，豁痰化瘀利水方可能通過(guò)抑制織MCP-1表達(dá)，抑制炎性通路活化，減輕炎性反應(yīng)，減輕腦水腫，并促進(jìn)血腫的消散。此結(jié)果與有關(guān)研究一致，進(jìn)一步表明豁痰化瘀利水方對(duì)改善ASDH具有一定的作用。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，經(jīng)刺激活化后能夠調(diào)控多種細(xì)胞因子、趨化因子等蛋白合成，并促使釋放大量炎性細(xì)胞因子，參與ASDH引起的炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生的炎性瀑布反應(yīng)可進(jìn)一步引起繼發(fā)性腦損傷[13]；NF-κB在腦損傷中同時(shí)具有雙重作用，可促進(jìn)炎性反應(yīng)引起神經(jīng)損傷，同時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用[14]。還有研究認(rèn)為，NF-κB是調(diào)節(jié)腦損傷后炎性反應(yīng)的重要靶點(diǎn)，其不僅可介導(dǎo)多種炎性因子的表達(dá)，也是調(diào)節(jié)腦損傷后炎性反應(yīng)的重要信號(hào)調(diào)控因子[15,16]。有關(guān)研究認(rèn)為，化瘀滌痰湯對(duì)急性硬膜下血腫大鼠腦組織NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，且對(duì)ASDH大鼠也有明顯的治療作用[16]。

本研究結(jié)果顯示，不同組 NF-κB mRNA及蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著豁痰化瘀利水方劑量升高， NF-κB mRNA及蛋白水平呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且效果與劑量呈依賴關(guān)系，表明NF-κB與ASDH的發(fā)生密切相關(guān)，而豁痰化瘀利水方能夠通過(guò)降低NF-κB的表達(dá)而達(dá)到改善ASDH，推測(cè)其作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的平衡而實(shí)現(xiàn)的?？赡苁潜痉絼┲泻械?、當(dāng)歸、水蛭等藥物，丹參能夠抑制NF-κB的表達(dá)與活性，使多種炎性因子基因轉(zhuǎn)錄減少，減少炎性遞質(zhì)釋放，緩解炎性因子損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)；而當(dāng)歸具有增強(qiáng)免疫力、抗炎、清除自由基、抗血栓形成及改善血液循環(huán)等作用，當(dāng)歸能夠降低氧化自由基對(duì)NF-κB的活化引起的炎性反應(yīng)，諸藥合用對(duì)ASDH發(fā)揮較好的改善作用。

綜上所述，豁痰化瘀利水方能夠有效減少急性硬膜下血腫面積，降低腦組織中MCP-1、NF-κB的表達(dá)，其效果與豁痰化瘀利水方劑量關(guān)系密切，值得后期進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、增加腦損傷指標(biāo)等進(jìn)行深入研究，以期為急性硬膜下血腫患者的治療提供一定參考依據(jù)。