結核感染T細胞斑點試驗假陰性影響因素回歸分析

梁麗麗 呂婭敏 馬 蕓 劉 新 孫書貞 張國龍

我國是世界上結核病負擔最重的6個國家之一，僅次于印度、印度尼西亞。2010年我國第5次結核病流行病學抽樣調查顯示,15歲及以上人口中活動性肺結核患病率為459/10萬，患者高達499萬(471萬～527萬)，涂陽肺結核患者有72萬(58萬～86萬)[1]。2015年全球估計共有1040萬例新發(fā)結核病例。在這1040萬新發(fā)病例中，檢出和正式通報病例僅有610萬例，遺漏病例高達430萬例。結核病早期診斷仍是全球面臨的重大挑戰(zhàn)[2]。快速、準確、及時地診斷結核病成為控制結核病疫情的關鍵。

近年來發(fā)展起來的γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assays,IGRAs)為結核病的診斷提供了新途徑，它是用產生γ-干擾素(IFN-γ)的T淋巴細胞是否對結核分枝桿菌特異性抗原有記憶，來判斷機體是否感染過結核分枝桿菌。國內外研究表明IGRAs對活動性結核病診斷的綜合敏感度為85%～90%，綜合特異性為85%～97%[3，4]。IGRAs檢測方法目前常用的試劑盒包括QuantiFERON-TB Gold test(QFT)、酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和結核分枝桿菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)，其中T-SPOT.TB被認為是檢測T淋巴細胞反應敏感度和特異性最高的方法，其檢測僅需采集5～6ml靜脈血，體外培育24h即可得到結果[5]。雖然T-SPOT.TB對活動結核病的診斷有很高的特異性，但其作為一種體外結核病診斷方法，仍不能完全排除假陰性。目前對于T-SPOT.TB假陰性檢測結果進行深入分析的研究并不多見,故本研究擬通過分析224例T-SPOT.TB結果為陰性的活動性結核病患者的臨床資料，并與同期收治的253例T-SPOT.TB結果為陽性的活動性結核患者進行比較，以期尋找與T-SPOT.TB結果假陰性結果相關的獨立影響因素，進而為今后臨床的輔助診斷提供一定的思路。

對象與方法

1.對象：回顧性分析2016年1月～2017年9月河南省胸科醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院診治的、臨床或實驗室診斷為活動性結核病的初治患者1760例。納入標準依據(jù)WHO的結核病診斷標準，其中確診活動性結核病的標準為：痰/其他標本TB-DNA陽性者或培養(yǎng)結果為結核桿菌[6]；臨床診斷為活動性結核病的標準為：臨床表現(xiàn)和影像學表現(xiàn)支持結核，且抗結核治療有效。根據(jù)T-SPOT.TB檢測結果分為兩組，即陰性組224例，陽性組1536例。為減少實驗室誤差及兩組因兩組樣本量差別大引起的統(tǒng)計學偏差，最終選擇同天入組的477例進行統(tǒng)計學分析。陰性組224例，其中男性151例，女性73例，患者年齡11～89歲，中位年齡為50歲。TB-DNA陽性或結核菌培養(yǎng)陽性的患者148例，臨床診斷結核76例。陽性組253例，其中男性157例，女性96例，患者年齡8～89歲，中位年齡為36歲。TB-DNA陽性或結核菌培養(yǎng)陽性的患者186例，臨床診斷67例。所有病例人免疫缺陷病毒(HIV)檢測均為陰性，無妊娠或免疫抑制劑用藥史。

2.T-SPOT.TB檢測：所有患者均在抗結核治療前行T-SPOT.TB檢測，采用T-SPOT.TB試劑盒(英國Oxford Immunotech公司，批號：TEC053921) 并嚴格按照試劑盒說明書進行。采集靜脈血4～6ml，肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離出外周血單個核細胞(PBMC)，將濃度調整為2.5×106/ml的細胞懸液。每例測試樣本需要4個檢測孔：無血清的細胞培養(yǎng)液作為陰性對照，植物血凝素(PHA)作為陽性對照，特異性抗原ESAT-6和CFP-10作為刺激抗原，每孔加入100μl細胞懸液(即每孔加入的細胞數(shù)為25萬個)，將培養(yǎng)板放在含有37℃，5%CO2，濕度適中的的培養(yǎng)箱中孵育16～20h。加入酶標二抗后再于2～8℃孵育1h，洗板后每孔加50μl顯色液室溫避光反應7min，蒸餾水終止反應，干燥后使用顯微鏡進行斑點計數(shù)。并按照說明書的判讀標準進行結果判定。

3.統(tǒng)計學方法：首先對回顧性研究結果進行單因素Logistic回歸分析，選取差異有統(tǒng)計學意義和臨床意義的因素再進行多因素的Logistic回歸分析，最后確定與T-SPOT.TB結果假陰性相關的獨立影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。用調整的比值比(OR) 及95% 的可信區(qū)間(CI) 估計各因素與T-SPOT.TB結果假陰性的聯(lián)系強度。

結 果

1.臨床病例情況：在224例T-SPOT.TB陰性組結核病患者中，肺外結核4例(淋巴結結核4例)，肺結核207例(肺組織結核134例，結核性胸膜炎10例，肺組織結核合并氣管結核33例，肺組織結核合并胸膜結核30例)，肺結核合并肺外結核患者13例(肺結核合并淋巴結結核3例，肺結核合并胸壁結核10例)。在253例陽性組結核病患者中，肺外結核5例(淋巴結結核5例)，肺結核219例(肺組織結核169例，結核性胸膜炎20例，肺組織結核合并氣管結核16例，肺組織結核合并胸膜結核11例，肺組織結核合并氣管、胸膜結核3例)，肺結核合并肺外結核29例(肺結核合并結核性腹膜炎7例，肺結核合并胸壁結核5例，肺結核合并淋巴結結核5例，肺結核合并結核性腦膜腦炎5例，肺結核合并骨關節(jié)結核4例，肺結核合并腹腔、骨關節(jié)結核1例，肺結核合并腹腔、腸結核2例)。兩組患者的基本資料見表1。

2.單因素Logistic回歸分析:變量賦值表見表2。采用單因素Logistic分析分別研究各指標與假陰性的相關性，結果顯示年齡(OR=1.046，95% CI：1.034～1.059)、淋巴細胞計數(shù)(OR=0.231，95% CI：0.162～0.330)、單核細胞計數(shù)(OR=0.281，95% CI：0.162～0.488)對假陰性的影響可能存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。淋巴細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)是假陰性的保護因素，淋巴細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)越高，發(fā)生假陰性的可能性越低。年齡是假陰性的危險因素，年齡每增加1歲，假陰性的風險增加0.046倍。性別、ESR、WBC等其他因素對假陰性的影響無統(tǒng)計學意義。單因素Logistic回歸分析T-SPOT.TB假陰性結果的危險因素見表3。

表1 兩組患者基本資料

3.多因素Logistic回歸分析：為了消除混雜因素的干擾，同時剔除掉單因素分析中無統(tǒng)計學意義的性別因素，進一步分析各危險因素之間的真實效應。以是否假陰性為因變量，單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的年齡、淋巴細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)為自變量，進行二元Logistic逐步回歸分析，納入和排除標準為0.05和0.10?；颊吣挲g(OR=1.045，95% CI：1.031～1.059)、淋巴細胞計數(shù)(OR=0.242，95% CI：0.164～0.356)、單核細胞計數(shù)(OR=0.254，95% CI：0.134～0.480), 可以認為年齡、淋巴細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)是假陰性的獨立影響因素(表4)?；颊吣挲g每增加1歲，出現(xiàn)假陰性的獨立風險增加0.045倍，淋巴細胞計數(shù)每升高1×109/L，出現(xiàn)假陰性的獨立風險降低0.242倍，單核細胞計數(shù)每升高1×109/L，出現(xiàn)假陰性的獨立風險降低0.254倍。

表2 多因素Logistic回歸分析變量賦值表

表3 T-SPOT.TB結果假陰性危險因素的單因素Logistic回歸分析

表4 T-SPOT.TB結果假陰性影響因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

目前診斷結核病的方法主要有涂片染色法、結核菌培養(yǎng)法、分子基因生物學方法等，但這些檢查都需要有足夠量的標本才能進行。而臨床工作中很多情況下無法獲得充足的標本，成為了制約結核病診斷的瓶頸。IGRAs由于只需血液標本就能進行檢測，在缺少標本導致無法進行病原學檢測時，可作為活動性結核的輔助診斷方法，尤其對于肺外結核的診斷有很大意義。國內外研究表明IGRAs對活動性結核病診斷的敏感度為85%(95% CI: 84%～86%)，特異性為84%(95% CI:83%～85%)，與本研究中T-SPOT.TB診斷活動性結核病的敏感度(87.3%,1536/1760)相似[3,6]。

IGRAs檢測陰性結果表示盡管對照抗原刺激后T細胞分泌正常，但結核分枝桿菌特異性抗原刺激后IFN-γ產生不足或不產生。理論上表明受試者體內沒有結核分枝桿菌特異性抗原致敏的T淋巴細胞，也就代表受試者未感染結核分枝桿菌。因為有部分假陰性結果的存在，在臨床工作中常導致結核診斷的延誤和錯判。

結核分枝桿菌感染人體后，細胞免疫開始發(fā)揮作用。巨噬細胞分泌MHCⅡ類抗原遞呈并與有αβ-T細胞受體的未定型CD4Th細胞前體結合，巨噬細胞分泌的IL-12促進幼稚型CD4T淋巴細胞分化為Th1細胞，后者分泌IFN-γ。在此過程的任一細胞出現(xiàn)功能減低，都會造成IFN-γ分泌減少，從而出現(xiàn)假陰性結果。以往文獻報道，T-SPOT.TB雖然有很高的陰性預測值,但實際上其檢測結果可能會受到藥物(環(huán)氧化酶抑制劑、T細胞活化抑制劑)、HLA分型等影響[7～10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，對于結核患者，224例假陰性組病例的患者平均年齡為50歲，顯著高于253例陽性組病例的患者平均年齡36歲。曾有文獻證實隨著年齡的增長，免疫細胞逐漸減少，導致抗體免疫力逐漸下降，對結核抗原的應答能力也趨于下降[11]。而肺結核的小鼠模型也發(fā)現(xiàn)，年長小鼠和年輕小鼠的輔助T1淋巴細胞(Th1)數(shù)量有差別，且老年小鼠抗原特異性CD4+T細胞免疫功能受損[12]。Liao等[13]曾報道在合并HIV陽性的結核患者中，其IGRAs結果不確定或結果陰性，可能與T細胞絲裂原反應被抑制有關。本研究證實年齡的增長是T-SPOT.TB結果出現(xiàn)假陰性的獨立影響因素，與Hang等[9]和Azghay等[14]報道一致。

本研究中，假陰性組患者的外周血淋巴細胞計數(shù)明顯低于陽性組患者，其原因可能為：T淋巴細胞在宿主對結核分枝桿菌感染的免疫應答中起關鍵作用，Th1細胞分泌IFN-γ參與細胞介導的特異性免疫應答，且對MTB感染的保護性免疫更依賴于T淋巴細胞的反應。淋巴細胞的減少，使宿主對結核抗原缺乏應答。動物實驗也證實：缺乏T淋巴細胞的獼猴，或感染了猴免疫缺陷病毒(SIV)的獼猴，顯示出對活動性結核或結核再感染的易感性增加[15～17]。正因為淋巴細胞減少，且對結核抗原的應答下降，使結核分枝桿菌特異性抗原刺激后T淋巴細胞分泌IFN-γ不足或不產生，從而使T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性的結果。

在結核分枝桿菌侵入人體后，宿主產生的細胞免疫反應中單核-吞噬細胞是抗原遞呈細胞和主要的抗菌效應細胞。單核細胞是結核感染免疫的重要起始和效應細胞，在吞噬抗原后將所攜帶的抗原決定簇轉交給淋巴細胞，誘導淋巴細胞產生特異性免疫反應。而單核細胞減少，必將導致抗原遞呈降低從而使幼稚型CD4T淋巴細胞分化為Th1細胞減少，引起IFN-γ分泌不足或不產生。本研究發(fā)現(xiàn)，較低數(shù)目的單核細胞是產生T-SPOT.TB假陰性結果的獨立影響因素。

在單因素回歸分析中，本研究發(fā)現(xiàn)合并糖尿病不是T-SPOT.TB假陰性結果的影響因素。但Faurholt-Jepsen等[18]曾報道，糖尿病與結核分枝桿菌特異性IFN-γ水平下降有關，空腹血糖越高，結核分枝桿菌特異性IFN-γ水平越低。而Walsh等[19]也報道，T-SPOT.TB檢測的敏感度不會因患者合并糖尿病而降低。本研究的回歸分析發(fā)現(xiàn)空腹血糖升高并不是導致T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性結果的獨立影響因素。筆者認為，出現(xiàn)不同結論也許與合并糖尿病的結核患者是否應用降糖藥物，是否血糖得到控制有關。在本研究中，假陰性組40%(16/40)患者未經過降糖藥物治療，其空腹血糖超過10.0mmol/L，其余假陰性組60%合并糖尿病的結核患者已經過降糖藥物治療。Tan等[20]也曾觀察到，在血糖控制良好的糖尿病合并結核患者，T-SPOT.TB檢測的陰性預測值明顯高于血糖控制不佳的患者。

在本研究中，兩組病例在結核病史、是否合并肺外結核及是否合并糖尿病等合并癥上未有明顯差異，且兩組病例在紅細胞沉降率、C反應蛋白等指標中未出現(xiàn)差異，與以往文獻報道不同[21]?？赡芘c患者處于疾病不同階段有關,紅細胞沉降率和C反應蛋白均是反應感染的指標，而Azghay等[14]認為合并細菌感染會使IGRAs結果呈假陰性。但因條件所限，本研究并未進一步觀察PPD硬結直徑與T-SPOT.TB結果之間的關系，也未觀察到重癥、輕癥結核患者對T-SPOT.TB結果的影響，還需今后開展更全面的臨床研究加以闡明。

綜上所述，對于疑似結核的老年患者，或淋巴細胞降低、單核細胞降低的疑似結核患者，即使T-SPOT.TB結果為陰性，也應結合臨床，判斷是否為細胞免疫功能低下導致的T-SPOT.TB結果為假陰性，避免因假陰性結果延誤診斷及治療。