高效液相色譜法測(cè)定可可粉中可可殼含量

張九魁, 賈楠, 柯潤(rùn)輝*,王爍, 李曉斌, 尹建軍

1(中國(guó)焙烤食品糖制品工業(yè)協(xié)會(huì)，北京，100083)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京，100015)

可可粉是采用直接加工處理方法從可可豆中得到的可可制品，是當(dāng)今世界三大嗜好性飲料之一[1]。由于受到可可產(chǎn)地及產(chǎn)量的限制，可可粉原料供給不足，大量劣質(zhì)或者假冒的可可粉開(kāi)始出現(xiàn)在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)[2]。由于可可殼粉碎后從肉眼上難以與可可粉區(qū)別，一些不法企業(yè)以飼料名義進(jìn)口可可殼，粉碎加工后噴上可可香精，然后摻到可可粉中，牟取暴利。此外，在可可粉的生產(chǎn)過(guò)程中，殘存可可殼的含量是可可粉質(zhì)量控制的一個(gè)重要參數(shù)，也是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家可可粉貿(mào)易中的一個(gè)重要質(zhì)量指標(biāo)[3]。而目前國(guó)內(nèi)的可可粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只是簡(jiǎn)單地在感官和理化要求上做了規(guī)定[4]，對(duì)可可粉中可可殼含量沒(méi)有做出限量規(guī)定，尚沒(méi)有可行的檢測(cè)方法來(lái)鑒別。

鑒別可可粉中可可殼，最初是通過(guò)顯微鏡觀察識(shí)別石細(xì)胞，該方法操作較簡(jiǎn)單，但較費(fèi)時(shí)，且難以準(zhǔn)確定量。金永生等[5]建立了PCR法，檢測(cè)可可粉中添加外源植物源性成分，但該方法易受雜質(zhì)影響，且不能鑒別可可殼這種主要的內(nèi)源性摻假物[2]。胡明華等[2]用HPLC-指紋圖譜結(jié)合系統(tǒng)聚類分析法可對(duì)摻入15%及以上可可殼的可可粉予以鑒別。但此方法也存在操作復(fù)雜，不便推廣等缺點(diǎn)。MEYER[6]發(fā)現(xiàn)，脂肪酸色酰胺類物質(zhì)在可可殼中含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于可可粉中含量，因此可用作指示物來(lái)鑒別可可粉中可可殼含量。基于這個(gè)原理，F(xiàn)INCKE和SACHER[7]開(kāi)發(fā)了分光光度法測(cè)定可可粉中脂肪酸色酰胺濃度來(lái)計(jì)算可可殼含量，是目前國(guó)際可可、巧克力及糖果協(xié)會(huì)(International Office of Cocoa, Chocolate and Sugar Confectionary, IOCCC)官方檢驗(yàn)方法[8]，但是這個(gè)方法的靈敏度相對(duì)較低。MüNCH等[9]建立了液相色譜分析脂肪酸色酰胺的方法，并嘗試將其用于測(cè)定市售巧克力產(chǎn)品中可可殼含量?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本文建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定可可粉和可可殼中二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺的定量分析方法，再根據(jù)樣品中脂肪酸色酰胺含量與可可殼含量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，建立定量鑒別模型，對(duì)可可粉中可可殼含量進(jìn)行定量分析鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：乙腈、乙酸乙酯、正己烷(色譜純)，美國(guó)J.T.Baker公司；四氫呋喃(色譜純)，美國(guó)ThermoFisher公司)；三氯甲烷(分析純)，北京化工廠；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：二十二烷酸色酰胺(behenic acid tryptamide, BAT)、二十四烷酸色酰胺(lignocerinic acid tryptamide, LAT)(純度≥99%)標(biāo)準(zhǔn)品(均為固體)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。2種脂肪酸色酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺的
化學(xué)結(jié)構(gòu)式
Fig.1 Chemical structures of the two fatty acid tryptamides

分別準(zhǔn)確稱取0.010 0 g的BAT和LAT標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用四氫呋喃(tetrahydrofuran, THF)溶解并定容至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。上述標(biāo)準(zhǔn)溶液置于冰箱中-18 ℃保存，根據(jù)使用需要，用流動(dòng)相溶液逐級(jí)稀釋配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

樣品：9批次不同來(lái)源可可粉樣品(F1～F9)和4批次可可殼樣品(K1～K4)，產(chǎn)地分別為印度尼西亞、厄瓜多爾、喀麥隆和加納，均由中國(guó)焙烤食品糖制品工業(yè)協(xié)會(huì)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(LC-10AT VP，配有熒光檢測(cè)器)，日本島津公司；高速多功能粉碎機(jī)(BJ-150型)，浙江德清拜杰電器有限公司；超純水發(fā)生器(Milli-Q Reference)，美國(guó)Millipore公司；超聲波清洗器(KQ-500DE)，昆山市超聲儀器有限公司；高速離心機(jī)，北京雷勃爾離心機(jī)公司，最大轉(zhuǎn)速10 000 r/min；Vortex Genius 3渦旋混勻器，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；氮吹儀，北京帥恩科技有限責(zé)任公司；12通道固相萃取裝置，美國(guó)J.T.Baker公司；硅膠固相萃取柱和中性氧化鋁固相萃取柱(500 mg/6 mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備與前處理

將可可殼樣品用高速多功能粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，貼明標(biāo)簽，備用。

準(zhǔn)確稱取1.00 g可可粉或可可殼粉樣品于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL CHCl3，渦旋振蕩3 min，超聲提取10 min，9 000 r/min離心10 min，上清液用快速定性濾紙過(guò)濾于10 mL比色管中，氮吹干，用四氫呋喃溶解并定容至1.0 mL，待凈化。

用3 mL正己烷/乙酸乙酯溶液[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=9∶1]活化硅膠柱，取0.2 mL樣液加于活化后的硅膠柱中，依次用5 mL正己烷/乙酸乙酯溶液[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=9∶1]、3 mL正己烷/乙酸乙酯溶液[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=8∶2]淋洗，最后用15 mL乙酸乙酯洗脫硅膠柱并收集洗脫液，將洗脫液于40 ℃水浴中氮吹干，然后用1 mL流動(dòng)相溶解，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，待進(jìn)樣分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：博納艾杰爾Venusil C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈+四氫呋喃+水[V(乙腈)∶V(四氫呋喃)∶V(水)=90∶7∶3]；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)為281 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為330 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式的優(yōu)化

為達(dá)到高效、短時(shí)的提取目的，采用渦旋振蕩配合超聲提取的方式，并考察超聲時(shí)間對(duì)提取的影響。實(shí)驗(yàn)選取2個(gè)可可殼粉樣品，各取5組，先渦旋振蕩3 min，然后分別超聲提取5、10、15、20和30 min，然后對(duì)比提取效果(圖2)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響
Fig.2 Effect of different ultrasonic extraction duration
time on the target compounds

由圖2可見(jiàn)，超聲10 min以后樣品中BAT+LAT含量趨于穩(wěn)定，說(shuō)明再延長(zhǎng)超聲時(shí)間對(duì)提取影響不明顯。因此，確定渦旋振蕩3 min結(jié)合超聲波提取15 min的方式作為樣品提取方法。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)脂肪酸色酰胺的性質(zhì)，選用常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(C18)的反相色譜柱，比較了Venusil C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Innoval C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)的出峰和分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：兩款C18柱均能將BAT和LAT完全分離，Venusil C18色譜柱由于應(yīng)用了鈍化的硅膠表面處理技術(shù)和先進(jìn)的鍵合工藝，在用于各類非極性和中等極性化合物的分離時(shí)呈現(xiàn)出良好的色譜峰形，相對(duì)來(lái)說(shuō)峰形尖銳而對(duì)稱，出峰較早，可在15 min內(nèi)完成出峰，因此實(shí)驗(yàn)選擇Venusil C18柱作為分析柱。

試驗(yàn)考察了以甲醇、乙腈、四氫呋喃和水的不同配比為流動(dòng)相進(jìn)行分離，結(jié)果表明：乙腈、四氫呋喃和水的體積比為90+7+3，2種目標(biāo)物質(zhì)的分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性均優(yōu)于其他比例，基線穩(wěn)定，分離度好，無(wú)其他成分干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 兩種脂肪酸色酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC標(biāo)準(zhǔn)色譜圖
Fig.3 Chromatogram of the BAT and LAT mixed
standard solution

2.3 凈化柱的選擇

固相萃取方法中常用的正相固相萃取柱為硅膠柱和氧化鋁柱。本研究考察了不同填料的固相萃取柱對(duì)脂肪酸色酰胺提取回收率的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：使用硅膠柱和中性氧化鋁柱時(shí)，脂肪酸色酰胺的回收率均大于90 %；使用硅膠柱凈化樣品時(shí)，基線平穩(wěn)且雜質(zhì)少，目標(biāo)物峰明顯(圖4)，符合定量分析要求。本研究最終選用硅膠填料固相萃取柱。

a-經(jīng)中性氧化鋁固相萃取柱凈化；b-經(jīng)硅膠固相萃取柱凈化圖4 可可粉和可可殼樣品中2種脂肪酸色酰胺HPLC譜圖Fig.4 Chromatograms of the BAT and LAT in cocoapowder and cocoa shell samples

2.4 線性參數(shù)及檢出限、定量限

分別移取1 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成50、100、200、500和1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液，在1.3.2所述的色譜條件下，各進(jìn)樣10 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在50～1 000 μg/L的濃度范圍內(nèi)，分析物的質(zhì)量濃度(X)和峰面積(Y)之間的線性關(guān)系良好，采用外標(biāo)法對(duì)進(jìn)樣的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r)。

表1 兩種脂肪酸色酰胺的線性方程、線性范圍和檢出限Table 1 Linearity parameters, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of two FATs

在可可粉樣品中添加低濃度的BAT和LAT混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，測(cè)定檢出限和定量限。結(jié)果表明：BAT和LAT的質(zhì)量濃度和峰面積在50～1 000 μg/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 1，檢出限(LOD, S/N=3)和定量限(LOQ, S/N=10)分別為0.03 mg/kg和0.1 mg/kg(表1)。說(shuō)明本方法適合實(shí)際樣品的測(cè)定。

2.5 方法的回收率和精密度

采用在已知樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，取可可粉樣品(F1)作為實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，考慮到可可粉樣品中的本底，BAT和LAT添加濃度設(shè)5、10和20 mg/kg 3個(gè)水平，分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，由表2可知，2種目標(biāo)物質(zhì)的回收率在92%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)為2.1%～6.2%。由此可知本方法的回收率和精密度均符合分析要求。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Recoveries and RSDs of two FATs bystandard addition method (n=3)

注：本底值、測(cè)定值和回收率為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

將可可粉樣品和可可殼樣品按1.3.1進(jìn)行處理，按1.3.2色譜條件下進(jìn)樣分析。采用外標(biāo)法對(duì)實(shí)測(cè)樣品的2種脂肪酸色酰胺進(jìn)行定性定量分析。樣品測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 可可粉和可可殼樣品中2種脂肪酸色酰胺的含量(n=3)Table 3 The contents of two FATs in studied cocoapowder and cocoa shell samples (n=3)

注：FAT的值為BAT和LAT含量之和。

由表3可以看出，2種脂肪酸色酰胺類物質(zhì)在4批可可殼中含量為208.9～228.8 mg/kg，在9批可可粉中含量為2.6～12.1 mg/kg，在可可殼中含量是其在可可粉中含量的17～88倍，平均含量為25倍。此外，由表3可以看出，除K2樣品值稍大外，LAT和BAT兩種物質(zhì)在不同來(lái)源的可可粉和可可殼中的含量比值基本保持穩(wěn)定狀態(tài)，即LAT的含量是BAT的2.1±0.4倍，說(shuō)明在可可豆成熟后兩者的含量比值穩(wěn)定。上述研究結(jié)果表明，這2種物質(zhì)是穩(wěn)定存在于可可中特有的脂肪酸色酰胺，且在殼中含量遠(yuǎn)大于豆仁中含量，因此這2種物質(zhì)可以作為特征指示物用來(lái)鑒別可可粉中是否含有可可殼粉，且可以通過(guò)測(cè)定樣品中這2種脂肪酸色酰胺的含量來(lái)推算可可粉中可可殼的含量比例。

2.7 鑒別模型的建立

為了鑒別可可粉中摻入可可殼粉的含量比例，本試驗(yàn)?zāi)M制備10個(gè)摻入不同比例質(zhì)量分?jǐn)?shù)可可殼粉的可可粉樣品(為了保險(xiǎn)起見(jiàn)，特地選用FAT含量最高的粉樣品和FAT含量較低的殼樣品)，可可粉中分別摻入了5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的可可殼。利用上述前處理和色譜條件測(cè)定了這些樣品中BAT和LAT含量(表4)。

表4 模擬摻入可可殼粉的10個(gè)可可粉樣品中2種脂肪酸色酰胺含量Table 4 The contents of two FATs in 10 simulatedadulteration of cocoa powder samples

從感官上判斷，摻入了可可殼粉的可可粉，在顏色、氣味等物理性質(zhì)方面與純的可可粉很難區(qū)分。但由表4中數(shù)據(jù)可以看出，隨可可殼粉添加量的增加，模擬樣品中2種目標(biāo)物質(zhì)的含量也是按一定比例增加的，因此可以建立一個(gè)FAT(BAT+LAT)含量與可可殼添加量之間簡(jiǎn)單的線性關(guān)系定量鑒別模型：y=0.467 2x-7.503 6,r=0.999(x,FAT含量，mg/kg;y,可可殼摻入量,%)，通過(guò)本方法來(lái)計(jì)算樣品中檢測(cè)到的BAT和LAT的含量之和，就可以將摻入一定量可可殼粉的可可粉樣品從純可可粉樣品中區(qū)別出來(lái)。考慮到摻假比例的經(jīng)濟(jì)性與可操作性，當(dāng)摻入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))及以上可可殼時(shí)，應(yīng)用本方法可予以較好鑒別。

2.8 盲樣驗(yàn)證

為了驗(yàn)證方法的可靠性與適用性，本試驗(yàn)隨機(jī)選取4個(gè)可可粉樣品和4個(gè)可可殼樣品，兩兩一組按一定比例混合，模擬制成5個(gè)盲樣，然后從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)4個(gè)商品可可粉樣品，其中M1～M5表示5個(gè)模擬盲樣，S1～S4表示市售可可粉樣品。按1.3.1和1.3.2條件測(cè)定這些樣品中FAT含量，并按2.7所建立定量鑒別模型計(jì)算可可殼摻入比例(表5)。

表5 盲樣和市售可可粉樣品中2種脂肪酸色酰胺含量及模型計(jì)算結(jié)果(n=2)Table 5 Predicted deviation of adulterant amount of cocoashell in cocoa powder and commercially available cocoapowder samples (n=2)

結(jié)果表明：模型預(yù)測(cè)的盲樣摻入可可殼粉的值與實(shí)際含量之間有較好的對(duì)應(yīng)，預(yù)測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差在-10.4%～2.6%之間；模型預(yù)測(cè)的4個(gè)市售樣品的值均小于5%，說(shuō)明這些樣品中無(wú)人為摻加可可殼的情況，均為正常工藝生產(chǎn)的可可粉。因此，從行業(yè)監(jiān)管和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用角度來(lái)看，說(shuō)明本定量鑒別模型完全可行。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法檢測(cè)可可粉中二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺含量的方法，通過(guò)測(cè)定2種目標(biāo)物質(zhì)的含量，定量鑒別可可粉中可可殼的含量，從行業(yè)監(jiān)管的角度，不僅可用于可可粉質(zhì)量控制，還可用于鑒別出摻入可可殼5 %(占樣品質(zhì)量的百分含量)及以上的摻假可可粉。本方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高，可以滿足大量樣品的日常監(jiān)測(cè)，非常適合于可可制品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)可可粉原料質(zhì)量?jī)?yōu)劣的評(píng)價(jià)和摻假鑒別。