超聲波及超聲波結(jié)合酸處理優(yōu)化鰹魚肌原纖維蛋白功能特性

李長樂，武雅琴，王莉莎，鄒咪，湯嘉慧，李天祥,包海蓉，2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海)，上海，201306)

目前，捕撈鰹魚的主要漁場位于中西部太平洋水域，至2008年，該水域鰹魚產(chǎn)量已達170萬t[1]。鰹魚屬低值金槍魚，由于肉質(zhì)較酸，腥味重，口感差，紅肉含量高[2]等缺點，嚴(yán)重限制其開發(fā)與利用。但鰹魚富含蛋白質(zhì)(26.14%)[3]，而蛋白質(zhì)的凝膠性是食品加工過程中的一個熱動力學(xué)特性。在肉制品加工中，蛋白質(zhì)凝膠的形成嚴(yán)重影響成品的質(zhì)構(gòu)特性和感官特性。其中肌原纖維蛋白是形成凝膠的主要成分，占魚肌肉總蛋白含量的55%～60%，或骨骼肌質(zhì)量的10%[4]。蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)的形成分為變性和聚合兩步,凝膠結(jié)構(gòu)及其物理化學(xué)性質(zhì)取決于蛋白質(zhì)變性和聚集的相對速率，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)聚集速率低于展開速率時，有利于形成細致的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)聚集速率高于展開速率時，有利于形成無序、粗糙的凝膠結(jié)構(gòu)[5]。影響蛋白質(zhì)熱成膠的因素有很多，如蛋白質(zhì)種類、蛋白質(zhì)濃度、溫度、pH值、外源添加物等都會影響蛋白質(zhì)的凝膠質(zhì)構(gòu)和強度。其中pH值對蛋白質(zhì)凝膠有很重要的影響，pH值通過影響蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的解離程度，改變凝膠過程中蛋白質(zhì)的溶解度及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，進而影響蛋白質(zhì)的凝膠特性。當(dāng)pH值接近蛋白質(zhì)的等電點時，變性蛋白質(zhì)會因為疏水相互作用而形成隨機聚集物。當(dāng)pH值遠離等電點時，靜電斥力會阻止形成隨機聚集，導(dǎo)致形成線性多聚體[6]。因此，對魚肉肌原纖維蛋白進行改性，改善其凝膠強度和持水性對魚肉制品的加工具有重要意義。

由預(yù)試驗得出結(jié)論：超聲波處理能提升肌原纖維蛋白溶解度、乳化性等功能性質(zhì)，超聲3、6 min提高凝膠預(yù)備階段但不利于凝膠的形成。為實現(xiàn)超聲波對鰹魚肌原纖維蛋白性質(zhì)的全面改善，可以結(jié)合其他手段對蛋白質(zhì)進行改性。本實驗以超聲3 min為例，對鰹魚肌原纖維蛋白進行超聲波(3 min，振幅40%)處理及超聲波(3 min，振幅40%)結(jié)合酸(ultrasonic combined acid, GDL)處理后加熱，得到靜態(tài)聚集體，觀察超聲波及超聲波結(jié)合酸處理后，鰹魚肌原纖維蛋白流變性、質(zhì)構(gòu)、持水性以及溶解度的變化。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

鰹魚(Katsuwonuspelamis)(2015年購于浙江黃罐食品公司，-60 ℃冰箱冷藏)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、順丁烯二酸(maleicacid)、曲拉通(triton-100)、NaCl、KCl、酒石酸鉀鈉、無水CuSO4、Na2HPO4、NaH2PO4等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-100 CL型低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；D-130 電動勻漿機，Wiggens有限公司；GL-20B 高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；MCR301流變儀，奧地利安東帕公司；UV1100型紫外分光光度計，廣州罡然機電設(shè)備有限公司；SG2-ELK研究用酸度計，梅特勒-托利多公司；FA2004型電子分析天平，南京東邁科技儀器有限公司；AL104-IC型分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司； VC 750超聲波破碎儀，美國科爾帕默儀器有限公司； TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參考KATOH等[7]并作適當(dāng)?shù)男薷?。?zhǔn)確稱取5 g魚肉，加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內(nèi)含0.16 mol/L KCl,20%TritonX-100,pH 7.5),均質(zhì)(12 000 r/min,每次30 s，間隔1 min，重復(fù)4次)，離心(4 ℃，5 000 r/min,15 min),除上清液，繼續(xù)加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內(nèi)含0.16 mol/L KCl, pH 7.5)清洗沉淀。均質(zhì)-離心重復(fù)2次。用4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液清洗沉淀，離心棄上清液用8倍體積的0.1 mol/L NaCl清洗沉淀，紗布過濾，濾液離心，沉淀即為肌原纖維蛋白樣品，碎冰冷藏。

2.2 肌原纖維蛋白濃度的測定

雙縮脲法測肌原纖維蛋白的濃度[8]。

2.3 超聲波處理肌原纖維蛋白[9]

將肌原纖維蛋白稀釋至所需濃度，取適量蛋白樣品于玻璃燒杯中，將燒杯置于超聲波細胞破碎儀(超聲探頭為頻率 20 kHz，直徑 15 mm的鈦金屬探頭)，設(shè)置超聲振幅為40%，超聲時間為 3 min(超聲過程中工作時間和間歇時間分別為1 s和4 s)冰水浴控制樣品溫度為4～10 ℃，處理后的樣品于4 ℃冰箱內(nèi)儲存，24 h內(nèi)使用。

2.4 樣品凝膠的制備

鰹魚肌原纖維蛋白凝膠的制備參考田金河[10]的方法并做適當(dāng)改動。將60 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液轉(zhuǎn)移至 25 mL的燒杯中，每個燒杯中樣品各 20 mL。為防止凝膠劣化現(xiàn)象的出現(xiàn)，凝膠樣品的制備采用二步加熱法，即先在 40 ℃水浴穩(wěn)定1 h，然后再 90 ℃水浴穩(wěn)定30 min，制備靜態(tài)聚集體，靜態(tài)聚集體立即置于冰水中冷卻30 min，然后于 4 ℃條件下平衡24 h，備用。

將60 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液超聲處理3 min后，凝膠制備方法同上。

在超聲處理后的肌原纖維蛋白溶液中加入GDL，調(diào)整蛋白質(zhì)pH為5.7，攪拌充分溶解后，凝膠制備方法同上。

2.5 溫度掃描

上述2.4中制備的MP樣品(60 mg/mL)的流變特性的測定參考常海霞[11]的方法，溫度掃描測試選用平行錐板(PP50，d=49.985 mm)，測試應(yīng)變力為0.02，頻率0.1 Hz，縫隙1 mm，掃描溫度范圍為20～80 ℃，升溫速率為1 ℃/min，記錄G′的變化。

2.6 TPA測定

將2.4中制備的凝膠于室溫下平衡0.5 h(28～30 ℃)，采用TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測定凝膠樣品的質(zhì)構(gòu)特性。測定參數(shù)參考張自業(yè)的方法[12]：采用P/6探頭，測前速度：5.0 mm/s，測試速度：1.0 mm/s，測后速度：5 mm/s，下壓距離1 mm，觸發(fā)值10 g，數(shù)據(jù)采集速度100 pps。重復(fù)檢測5次。

2.7 持水性測定

持水性(water holding capacity, WHC)參考KOCHER等[13]的方法。將制備好的凝膠于4 ℃下10 000×g離心10 min，離心完成后，離心管倒置晾干，殘留的水分用干燥濾紙小心吸干，離心管質(zhì)量以及離心前后離心管和凝膠的總質(zhì)量精確稱重。WHC按公式(1)計算：

(1)

式中：W為離心管的質(zhì)量,g；W1為離心前凝膠和離心管的總質(zhì)量,g；W2為離心后凝膠和離心管的總質(zhì)量,g。每個處理3次重復(fù)。

2.8 溶解度的測定

肌原纖維蛋白溶液的溶解度測定方法如下：取5 mg/mL的MP溶液于離心管中，5 000 r/min，離心40 min后，用雙縮脲法測定上清液中吸光度值，BSA做為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

(2)

2.9 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)由SPSS 18.0進行分析處理；繪圖采用Origin 8.0軟件。

3 結(jié)果與討論

3.1 溫度掃描分析

如圖1可知，未經(jīng)處理的肌原纖維蛋白的G′(彈性模量)在整個加熱過程中分成3個階段，20～38 ℃為凝膠的準(zhǔn)備階段。38～47 ℃為凝膠劣化階段。47～80 ℃為凝膠強化階段。通過超聲波處理后的樣品其流變曲線同樣分為3個階段：20～38 ℃為凝膠預(yù)備區(qū)，38～47 ℃為凝膠劣化區(qū)，但與原樣相比， 47～80 ℃樣品的G′不再隨著溫度的上升而增加。而超聲波結(jié)合酸處理后的樣品其流變曲線變化趨勢與原樣相比，明顯增強了凝膠預(yù)備階段，隨著溫度的升高，凝膠強化階段的G′略高于未處理的樣品組，明顯高于單一超聲波處理組。由凝膠劣化階段可以看出，超聲波處理后的肌原纖維蛋白劣化現(xiàn)象非常嚴(yán)重，凝膠強化階段G′無明顯上升可能與劣化程度有關(guān)。而超聲波結(jié)合酸處理后，降低了凝膠劣化程度，使凝膠強化階段的G′迅速回升。因此綜合上述結(jié)論，超聲波結(jié)合酸處理對肌原纖維蛋白的改性要比單一的超聲波處理凝膠效果更好。

圖1 不同處理方式對鰹魚肌原纖維蛋白流變性的影響
Fig.1 Effects of different treatment methods on the
rheological properties of myofibrillar protein of skipjack

3.2 質(zhì)構(gòu)(硬度、彈性、凝聚性、咀嚼性)分析表

肌原纖維蛋白超聲處理后制備熱誘導(dǎo)凝膠，采用質(zhì)構(gòu)儀測定凝膠的硬度、彈性、凝聚性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性，探討超聲處理及超聲波結(jié)合酸處理對肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同處理后肌原纖維蛋白質(zhì)構(gòu)特性差異Table 1 The difference of structural properties of myofibrillar protein after different treatments

質(zhì)構(gòu)特性是凝膠的一個重要特性，決定了凝膠的品質(zhì)，由表1可知，超聲3 min處理后的肌原纖維蛋白的凝膠硬度、彈性、凝聚性、咀嚼性等各項質(zhì)構(gòu)特性明顯低于未處理的肌原纖維蛋白樣品的質(zhì)構(gòu)特性，且差異性很顯著(P<0.05)。這也與上述的流變曲線對比趨勢相吻合，單一的超聲波處理不利于肌原纖維蛋白凝膠的形成?？赡苁且驗榫奂w的結(jié)構(gòu)及其物理化學(xué)性質(zhì)取決于蛋白質(zhì)分子變性和聚集的相對速率。蛋白在加熱過程中會部分構(gòu)象改變，隨后分成2種途徑，部分改變構(gòu)象的蛋白質(zhì)要么發(fā)生聚集，要么進一步變性展開，超聲波處理促使了蛋白質(zhì)分子進一步展開，提高了蛋白質(zhì)的溶解度，增加了蛋白質(zhì)與水之間的吸引力，阻礙了蛋白質(zhì)之間的縱向交聯(lián)，導(dǎo)致形成凝膠的能力減弱。超聲波結(jié)合酸處理后制備的凝膠，其凝膠硬度、彈性與原樣相比，幾乎無明顯差別(P>0.05)，但凝聚性、咀嚼性呈明顯增加(P<0.05)?？赡苁怯捎诋?dāng)pH值接近蛋白質(zhì)的等電點時有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，會因為疏水作用而形成隨機聚集物，導(dǎo)致形成凝膠的能力增強。

3.3 持水性分析

當(dāng)鰹魚肌原纖維蛋白樣品超聲處理3 min后，二次加熱后冷卻，觀察到肌原纖維蛋白不能形成較大的聚集網(wǎng)絡(luò)，測其持水性為87.83%(如圖2)，可能是由于超聲波產(chǎn)生的瞬時高溫使部分蛋白質(zhì)變性，結(jié)構(gòu)受到破壞，溶解度增加，增強了蛋白質(zhì)與水之間的結(jié)合，導(dǎo)致保水性增加。

圖2 不同處理方式對鰹魚肌原纖維蛋白持水性的影響
Fig.2 Effects of different treatment methods on the water
retention of myofibrillar protein of skipjack

此結(jié)果也與CLEMENTS[14]的研究結(jié)果吻合，超聲波處理有利于肌原纖維蛋白的釋放，提升肉制品的持水性、嫩度等。而蛋白質(zhì)保留太多的水分在結(jié)構(gòu)中，就阻止了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的縱向交聯(lián)，不利于凝膠形成。而超聲波結(jié)合酸處理后，樣品的持水性與單一超聲波處理相比有明顯降低。可能是因為當(dāng)pH值接近等電點時，溶解度降低；隨著pH值偏離蛋白等電點，蛋白質(zhì)帶有凈電荷，增大了蛋白質(zhì)與水分子間的吸引力，生成更多的空間，使更多的水保留其中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度增大，凝膠保水性增強。此結(jié)果與FEI[15]、吳燁[16]的結(jié)果相類似，pH值偏離蛋白等電點，肌原纖維蛋白凝膠的保水性增強。

3.4 溶解度分析

經(jīng)不同方式處理后，鰹魚MP的溶解度變化如圖所示(圖3)，超聲3 min時，蛋白質(zhì)的溶解度從8.95%(未處理的MP)增加到25.1%(超聲3 min)，出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。而超聲3 min并結(jié)合酸處理后， MP樣品的溶解度為23.4%，與單一超聲波處理相比稍微降低但無明顯差別(P>0.05)，可能是因為pH值接近等電點時，蛋白的溶解度降低，但相比未處理組樣品的溶解度還是明顯增加。說明超聲波結(jié)合酸處理在提高肌原纖維蛋白凝膠性的同時也能促進肌原纖維蛋白的溶解，比單一的超聲波處理更有優(yōu)勢。

圖3 不同處理方式對鰹魚肌原纖維蛋白溶解度的影響
Fig.3 Effects of different treatment methods on the
solubility of myofibrillar protein of skipjack

4 結(jié)論

本實驗探究超聲波及超聲波結(jié)合酸處理后鰹魚肌原纖維蛋白流變性、質(zhì)構(gòu)、持水性、溶解度等性質(zhì)的變化，結(jié)果表明：超聲波結(jié)合酸處理后，明顯增強了MP凝膠預(yù)備階段，隨著溫度的升高，凝膠強化階段的G′略高于單一超聲波處理的樣品組；單一超聲波處理的肌原纖維蛋白明顯降低了質(zhì)構(gòu)特性且差異性很顯著(P<0.05)，超聲波結(jié)合酸處理后制備的凝膠，凝膠硬度、彈性與原樣相比，幾乎無明顯差別(P>0.05)，但凝聚性、咀嚼性呈明顯增加(P<0.05)；超聲波結(jié)合酸處理后，樣品的持水性與單一超聲波處理相比有明顯增加，但與未處理組相比偏低。說明隨著pH值偏離蛋白等電點，保水性增加；超聲波結(jié)合酸處理后的樣品的溶解度與原樣相比明顯增加，與單一的超聲波處理無明顯差別。本文在超聲波及超聲波結(jié)合酸處理對鰹魚肌原纖維蛋白部分功能性質(zhì)的影響方面取得了初步的進展，但是仍有許多研究內(nèi)容需要進一步的深入研究。例如：本文只研究了二次加熱法，即先在 40 ℃水浴穩(wěn)定 1 h，然后再 90 ℃水浴穩(wěn)定 30 min制備鰹魚肌原纖維蛋白凝膠，對其凝膠制備的加熱條件(時間和溫度)有待進一步優(yōu)化。