遼寧鳳城市紅松中松材線蟲的分離與鑒定

潘龍，理永霞,3，劉振凱，孟繁麗，陳軍，張星耀,3

(1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)新技術研究所，北京 100091； 2. 遼寧省鳳城市林業(yè)有害生物防治檢疫局，遼寧 鳳城 118100；3. 南京林業(yè)大學南方現代林業(yè)協同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

紅松Pinuskoraiensis以中國東北地區(qū)東部為中心在中國、日本、朝鮮、韓國、俄羅斯等國均有分布，總面積約30萬km2[1]，其中中國面積最多，廣泛分布于遼寧、吉林和黑龍江等地。紅松是著名的珍貴經濟樹木，且具有重要的生態(tài)價值，一旦受到松材線蟲病的危害，將會造成嚴重的經濟損失和生態(tài)損害。

松材線蟲病是一種以松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus為病原，墨天牛屬Monochamus昆蟲為主要媒介的復雜病害系統(tǒng)[2-3]。在我國松材線蟲病的傳統(tǒng)分布區(qū)，自然感病的寄主包括馬尾松Pinusmassoniana、黑松P.thunbergii、白皮松P.bungeana、華山松P.armandii、云南松P.yunnanensis等，全部為松科松屬樹種[4]。近年來松材線蟲由南向北逐漸擴張，并在此過程中不斷危害新寄主。2017年遼寧省鳳城市發(fā)生大面積紅松枯死現象，本研究對該地區(qū)紅松發(fā)病情況進行調查并對病原線蟲進行鑒定，以期為松材線蟲病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 紅松受害情況調查與樣品采集 2017年7月發(fā)現單株紅松針葉枯黃后，每天拍照記錄針葉變化情況，共持續(xù)90 d。2017年12月在鳳城市東湯鎮(zhèn)選擇枯死紅松比較集中的樣地(面積約為500 m×500 m)，根據針葉枯黃率將紅松分為3個健康等級，即健康(針葉枯黃率=0%)、半枯(0%<針葉枯黃率≤50%)和全枯(50%<針葉枯黃率)，隨機選擇樣地中3種健康等級的紅松，測量并記錄樹高、胸徑和健康等級，觀察羽化孔、排糞孔和刻槽，綜合判斷是否有天牛危害。隨機伐倒不同健康等級的紅松，其中全枯紅松10株，半枯紅松和健康紅松各5株。在離地1.5 m處各采集5 cm厚的木圓盤，共采集樣本20份，用于分離鑒定病原線蟲。

1.2 紅松中線蟲的分離與培養(yǎng) 采用貝爾曼漏斗法進行線蟲分離，24 h后用離心管收集線蟲分離液，離心后用200 μL移液槍吸取底部線蟲混合液滴至載玻片上進行觀察[5]。用10 μL移液槍挑取線蟲50頭，接種到灰葡萄孢菌培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，待灰葡萄孢菌被取食完畢，用蒸餾水將線蟲洗出，獲得大量線蟲成蟲。

1.3 病原線蟲的形態(tài)鑒定 用10 μL移液槍挑取培養(yǎng)獲得的線蟲成蟲和紅松中分離獲得的疑似擴散型3齡松材線蟲幼蟲滴至載玻片上，將其置于酒精燈火焰上方加熱3～5 s。線蟲熱殺后呈“(”形，加蓋玻片，制成臨時玻片，在顯微鏡下觀察并鑒定線蟲形態(tài)特征[7-8]。

1.4 病原線蟲的分子鑒定 用10 μL移液槍在顯微鏡下挑取50頭線蟲，從美國Axygen公司購買DNA制備試劑盒AP-MN-MS-GDNA-50，按照試劑盒要求的步驟提取線蟲DNA，進行PCR擴增和測序[9-10]。PCR擴增反應體系共25 μL，包括12.5 μL PCR Mix，正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，9.5 μL ddH2O。選擇ITS(上游引物F1：5′-CGT AAC AAG GTA GCT GTA-3′，下游引物V2：5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′)和28S(上游引物D2A：5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG -3′，下游引物D3B：5′-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3′)松材線蟲特異性引物。PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

2 結果與分析

2.1 紅松受害情況調查結果 7月8日發(fā)現單株紅松針葉變黃，首先是紅松底部針葉開始發(fā)黃(圖1A)，隨后紅松樹冠由下往上逐漸變?yōu)辄S褐色，28 d后樹冠頂端保留少量綠色針葉(圖1B)，48 d后樹冠針葉全部變?yōu)辄S褐色(圖1C)并伴隨有松針脫落現象(圖1D)，觀察81 d后圖中紅松大量松針脫落(圖1E)。

A. 發(fā)現受害初期；B.發(fā)現受害初期28 d后；C. 發(fā)現受害初期48 d后；D .發(fā)現受害初期65 d后；E. 發(fā)現受害初期81 d后圖1 單株紅松受松材線蟲危害后針葉變黃過程

鳳城市樣地中枯死紅松平均樹高為13.8 m，平均胸徑為33.1 cm。在半枯或全枯紅松樣本中全部發(fā)現有松材線蟲，在全枯紅松上均發(fā)現了天牛危害痕跡，且其中8株伴隨有藍變現象，在健康紅松中沒有發(fā)現松材線蟲和天牛危害痕跡(表1)。

表1 鳳城市松材線蟲病危害紅松調查情況

2.2 松材線蟲的形態(tài)鑒定結果 從灰葡萄孢菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的線蟲成蟲頭部均具有明顯的溢縮、口針和中食道球，其中雄蟲交合刺弓形，尾部有“鷹爪形”的尾尖突，雌蟲陰門位于蟲體中后部，有“指甲形”陰門蓋(圖2 A-E)。以上鑒定結果均符合松材線蟲成蟲的形態(tài)特征。12月份從鳳城市紅松中分離出來的線蟲包括腐生型線蟲、昆蟲寄生線蟲和松材線蟲，松材線蟲所占比例平均為91.5%，其中87.7%以上為擴散型3齡，其余為成蟲，沒有發(fā)現低齡幼蟲。擴散型3齡幼蟲頭部頂端有明顯的溢縮、口針纖細，中食道球卵圓形占體寬2/3左右，除頭部外體內充滿大量的脂肪粒，尾部成“指形”(圖2F-H)，紅松中分離并培養(yǎng)的松材線蟲形態(tài)測量值見表2。

A.雄蟲；B.雌蟲；C.成蟲頭部；D.雄蟲尾部交合刺；E.雌蟲尾部陰門蓋；F.擴散型3齡幼蟲；G.擴散型3齡幼蟲尾部；H.擴散型3齡幼蟲頭部圖2 紅松中分離和培養(yǎng)獲得松材線蟲形態(tài)特征

表2 紅松中分離并培養(yǎng)的松材線蟲形態(tài)測量值

注:N—測計的樣本數； L—體長(μm)；a—體長/最大體寬；b—體長/體前端至食道與腸連接處的距離；c—體長/尾長；Tail—尾長(μm)；St—口針長度(μm)；Ts—雌蟲尾尖突長；Sp—雄蟲交合刺長；LIII—擴散型3齡幼蟲。

2.3 松材線蟲的分子鑒定結果 選擇ITS和28S序列特異性引物，以紅松中疑似松材線蟲的DNA為模板進行PCR擴增和測序，測序結果片段長度分別為815 bp和713 bp。將兩個序列分別在NCBI上比對，發(fā)現與已提交的松材線蟲ITS序列KF025323.1、EF446943.1和AB294736.1的相似度為100%，同源覆蓋率為100%，E值為0，與已提交的松材線蟲28S序列DQ364687.1的相似度為100%，同源覆蓋率為100%，E值為0。以上分子測序結果結合樣地中紅松受害特征和線蟲形態(tài)特征，綜合判斷紅松中的病原線蟲為松材線蟲。

3 結論與討論

本文明確了松材線蟲在我國自然條件下開始危害紅松。松材線蟲可以感染的寄主有106種，其中自然感病的有60種。紅松、油松、樟子松、落葉松Larixgmelinii和冷杉Abiesfabri均為松材線蟲的寄主或潛在寄主，并在東北地區(qū)大面積分布。松材線蟲的媒介昆蟲有13種，全部為墨天牛屬[11]，其中云杉花墨天牛Monochamussaltuarius和云杉小墨天牛Monochamussutor在東北地區(qū)的分布區(qū)與松材線蟲寄主或潛在寄主分布區(qū)重疊。2016年在大連，2017年在丹東分別發(fā)現松材線蟲疫情。松材線蟲在東北地區(qū)蔓延迅速，急需對新疫區(qū)松材線蟲媒介昆蟲進行監(jiān)測，并對東北地區(qū)潛在寄主和非疫區(qū)發(fā)生松材線蟲病的可能性進行預測，加強監(jiān)測預警[12]。

本研究在野外采集到大量的松材線蟲擴散型3齡幼蟲，繁殖型松材線蟲幼蟲在低溫、種群密度高或缺少食物等不利環(huán)境下會向擴散型轉化[13]。冬季在鳳城市半枯紅松中也發(fā)現了大量整齊的擴散型3齡幼蟲，說明低溫可能是松材線蟲向擴散型轉化的主要因素，但其影響機制還需要進一步研究。