松果體及其褪黑素與大鼠乳腺癌Treg細胞和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達的相關(guān)性

黃玉鈿 陳義忠 周瑞祥 鄭曦 薛玉欽 吳進

(福建醫(yī)科大學(xué) 1附屬福州市第一醫(yī)院病理科，福建 福州 350009；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系)

多種內(nèi)在因素影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，大量研究表明，腫瘤細胞的免疫逃逸是腫瘤發(fā)生的重要機制，而調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞在腫瘤免疫逃逸過程中發(fā)揮重要的作用〔1，2〕，如何抑制腫瘤Treg細胞的產(chǎn)生已成為拮抗腫瘤侵襲進展研究的重要熱點之一。目前，褪黑素(MLT)對乳腺癌中Treg細胞的產(chǎn)生是否具有調(diào)節(jié)作用國內(nèi)外未見相關(guān)研究。本文研究乳腺癌大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌器官松果體及其分泌的MLT與乳腺癌外周血中CD4+CD25+Treg細胞比例變化的相關(guān)性；并研究Treg細胞發(fā)育及功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Fox)p3在乳腺癌組織中的表達，分析松果體及其MLT與乳腺癌組織中Foxp3+Treg細胞數(shù)量變化的相關(guān)性；探討神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)對乳腺癌中Treg細胞的產(chǎn)生是否具有調(diào)控作用，分析MLT對乳腺癌中腫瘤免疫相關(guān)因素的影響效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及取材 選用清潔級SD雌性大鼠150只，2月齡，體重(200±10)g，自由攝食標(biāo)準飼料及水，每日置于光照和黑暗環(huán)境下各12 h。隨機平均分成5組各30只：(1)正常組(不摘除松果體、不荷瘤，N組)；(2)荷瘤對照組(不摘除松果體，G組)；(3)松果體摘除并荷瘤+生理鹽水組(M0組)；(4)松果體摘除并荷瘤+7.5 mg/(kg·d)MLT組(M1組)；(5)松果體摘除并荷瘤+15 mg/(kg·d) MLT組(M2組)。同日對(3)～(5)組行松果體摘除術(shù)，次日對(2)～(5)組實施乳腺癌細胞接種，從接種日起對(3)～(5)組按各自分組補充方案，予以每日腹腔注射生理鹽水或MLT(購自美國Sigma-Aldrich公司)，時間均為每日18∶00，qd×9 d；接種后第10天，荷瘤模型建立成功并采所有鼠外周血，取(1)組正常乳腺組織及(2)～(5)組乳腺癌瘤體。

1.2建立大鼠松果體摘除模型 依據(jù)周瑞祥等〔3〕改良的大鼠松果體摘除模型制作方法，(3)～(5)組以2%戊巴比妥鈉麻醉，切開頭頂部皮膚，暴露頂骨和枕骨，用牙科渦輪高速牙床，以人字縫為中心，五邊形切開顱頂諸骨，結(jié)扎矢狀竇，暴露視野，摘除松果體，縫合頭皮，術(shù)后青霉素肌注。

1.3建立大鼠乳腺癌荷瘤模型 大鼠乳腺癌SHZ-88細胞株(購自中科院上海生命科學(xué)研究院)傳代培養(yǎng)：SHZ-88細胞株貼壁生長于25 cm3的培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，每隔3 d貼壁細胞融合度達70%～80%時傳代，先吸棄培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，加磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗細胞2次，用0.25%胰蛋白酶消化1 min，鏡下觀察細胞質(zhì)縮小，貼壁細胞不再融合時吸棄胰蛋白酶消化液，加入新鮮的培養(yǎng)基，反復(fù)吹打細胞層使之脫壁分散，形成單細胞懸浮狀態(tài)，分裝傳代至新的培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶中加入5 ml新鮮培養(yǎng)基并混勻，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后傳代細胞開始貼壁生長。取對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，在擬荷瘤大鼠的大腿內(nèi)側(cè)近腹股溝處皮下接種1次大鼠乳腺癌SHZ-88細胞懸液(按5×105個細胞/只大鼠)，接種后第10天，在接種處皮下可觸及腫瘤形成。

1.4流式細胞術(shù)檢測 抽取乳腺癌大鼠或正常大鼠外周血2 ml，肝素抗凝，采用雙色熒光直接標(biāo)記法流式細胞術(shù)，4 h內(nèi)檢測新鮮外周血中CD4+淋巴細胞、CD25+淋巴細胞、CD4+CD25+Treg細胞及CD4-CD25-細胞亞群。步驟如下：每份外周血取100 μl抗凝全血，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4抗體和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD25抗體(購自美國ThermoFisher科技公司，為小鼠抗大鼠單克隆抗體)各20 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，加入2 ml溶血劑，混勻后室溫避光孵育10 min，離心后棄上清液，加入2 ml PBS洗滌，離心后棄上清液，再加入500 μl PBS振蕩使細胞重懸，應(yīng)用流式細胞儀檢測，并于實驗中設(shè)立空白對照、同型對照及單陽對照。流式細胞術(shù)對乳腺癌大鼠或正常大鼠外周血中T淋巴細胞的CD4+、CD25+、CD4+CD25+Treg細胞和CD4-CD25-細胞亞群進行定量測定，得到CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量/CD4+T細胞數(shù)量的比例(%)，代表大鼠外周血中CD4+CD25+Treg細胞產(chǎn)生水平。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測 大鼠乳腺癌組織或正常大鼠乳腺組織經(jīng)4%中性甲醛固定、脫水，制成石蠟包埋組織塊，采用Elivision二步法免疫組織化學(xué)檢測(試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司)，檢測組織切片中Foxp3陽性淋巴細胞水平。具體步驟如下：石蠟包埋組織切片(厚5 μm)經(jīng)常規(guī)脫蠟并水化，檸檬酸高壓熱修復(fù)抗原，冷卻后PBS沖洗3次，每次3 min，加3%H2O2室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3次，滴加1∶150稀釋的Foxp3抗體(購自英國Biorbyt生物公司，為兔抗大鼠多克隆抗體)工作液，室溫孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次，加聚合物增強劑，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加酶標(biāo)抗鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，顯微鏡下控制染色時間，顯色后蒸餾水沖洗以結(jié)束染色，蘇木精襯染，自來水沖洗，經(jīng)酒精脫水干燥后，中性樹膠封片。實驗采用已知陽性片作為陽性對照，用PBS代替Foxp3抗體設(shè)立陰性對照。顯微鏡下觀察，大鼠乳腺癌或正常大鼠乳腺組織切片中細胞核染成棕黃色的淋巴細胞即為Foxp3+Treg細胞，在乳腺癌或正常乳腺小葉成分中隨機選擇10個高倍視野，計數(shù)其中Foxp3+Treg細胞總數(shù)，將結(jié)果換算成以個/mm2為單位，即代表大鼠乳腺癌或正常大鼠乳腺組織中Foxp3+Treg細胞的產(chǎn)生水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

G組外周血Treg細胞比例和乳腺癌組織Treg細胞數(shù)量顯著高于N組(P<0.01)。M0組外周血Treg細胞比例和乳腺癌組織Treg細胞數(shù)量顯著高于G組(P<0.01)。M1組外周血Treg細胞比例和乳腺癌組織Treg細胞數(shù)量顯著低于M0組、高于G組(P<0.05)。M2組外周血Treg細胞比例顯著低于M1組和M0組(P<0.01)；M2組與G組間外周血Treg細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。M2組乳腺癌組織Treg細胞數(shù)量顯著低于M0組、高于G組(P<0.01)；M2組與M1組乳腺癌組織Treg細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1和圖2。

表1 各組外周血CD4+CD25+Treg細胞比例及乳腺癌組織Foxp3+Treg細胞數(shù)量

1)與N組比較；2)與G組比較；3)與M0組比較；4)與M1組比較

圖1 乳腺癌和正常大鼠外周血中CD4+CD25+Treg細胞亞群(流式細胞術(shù)檢測)

圖2 乳腺癌和正常乳腺組織中Foxp3+Treg細胞(免疫組化法，×400)

3 討 論

機體對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)，尤其是T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫狀態(tài)異常是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要內(nèi)在因素之一。雖然特異性T細胞對腫瘤的免疫排斥作用始終存在，但其抗腫瘤作用有限，而Treg細胞介導(dǎo)的免疫耐受作用則通過抑制腫瘤抗原呈遞、分泌免疫抑制因子等機制導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸并不斷增殖和侵襲轉(zhuǎn)移〔4〕。天然Treg細胞是源于胸腺CD4+T細胞并能表達IL-2受體α鏈(IL-2Rα，CD25)的活化T細胞，占外周CD4+T細胞的3%～10%，具有免疫無能和免疫抑制兩大特征，能主動抑制免疫系統(tǒng)對自身和外來抗原的應(yīng)答〔5〕。研究表明在負荷腫瘤的機體中，Treg細胞數(shù)量較正常機體增加，Treg細胞數(shù)量與胃癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤惡性度呈正相關(guān)〔6～8〕。本研究結(jié)果提示荷乳腺癌機體的外周血和癌組織Treg細胞產(chǎn)生水平明顯高于正常機體，表明Treg細胞在乳腺癌的發(fā)生過程中起重要作用，其所介導(dǎo)的免疫耐受作用使乳腺癌細胞逃避機體免疫排斥而得以增殖浸潤。

如何抑制Treg細胞的產(chǎn)生是調(diào)節(jié)腫瘤免疫、抑制腫瘤進展的研究熱點之一。研究表明〔9〕松果體產(chǎn)生的MLT能影響胸腺中Treg細胞的發(fā)育及其功能，并對胸腺Treg細胞向外周血液循環(huán)的輸出過程也有調(diào)控作用，其機制包括MLT影響胸腺Treg前體細胞的發(fā)育周期、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)的細胞凋亡及外周血中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β活性等因素。本研究結(jié)果表明松果體的存在能抑制乳腺癌外周血中Treg細胞的產(chǎn)生，松果體中影響乳腺癌外周血Treg細胞生成的因素是松果體分泌的MLT，MLT能有效抑制乳腺癌外周血中Treg細胞的產(chǎn)生，且該作用有劑量依賴性。松果體是一個特殊的光感神經(jīng)內(nèi)分泌傳感器，對松果體功能的認識主要通過對其分泌的MLT的研究而獲得，MLT的化學(xué)本質(zhì)為N-乙酰-5-甲氧色胺，是一種具有多效應(yīng)信號功能的吲哚類激素，松果體分泌MLT具有明顯的晝夜節(jié)律性，夜晚分泌量明顯高于白天，但夜間光線照射能抑制其分泌量〔10〕。除了抗氧化、調(diào)節(jié)睡眠、抗衰老、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理功能之外，MLT的抗腫瘤作用研究也不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)MLT對子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等均有明顯的抑制作用〔11，12〕。MLT的抗腫瘤機制尚未完全明確，目前研究認為可能與抗雌激素、干擾微管蛋白和鈣調(diào)素、影響細胞代謝和細胞周期等作用有關(guān)〔13，14〕，而本研究結(jié)果則提示MLT在Treg細胞相關(guān)的腫瘤免疫方面也具有調(diào)節(jié)作用。MLT抑制乳腺癌Treg細胞的產(chǎn)生，提示惡性腫瘤逃避機體免疫系統(tǒng)的過程受到神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的“監(jiān)視”，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)可通過調(diào)控免疫系統(tǒng)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，兩個系統(tǒng)在穩(wěn)定機體內(nèi)環(huán)境及抗腫瘤過程中具有協(xié)同作用。

外周血中Treg細胞通過血液循環(huán)進入腫瘤組織發(fā)揮免疫耐受作用、促進腫瘤生長，腫瘤組織中Treg細胞的數(shù)量對腫瘤免疫微環(huán)境具有重要影響。Foxp3基因定位于Xp11.23，包含11個外顯子和10個內(nèi)含子，F(xiàn)oxp3特異性表達于CD4+CD25+Treg細胞上，是Treg細胞發(fā)育及功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也可用作機體組織中Treg細胞的特異性標(biāo)志物，在自身免疫性疾病和惡性腫瘤的病變組織免疫微環(huán)境中Foxp3+Treg細胞亞群具有增殖活性，可通過顆粒酶B/穿孔素途徑誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞和抗原提呈細胞凋亡，也可通過B7同源物(B7H)1/程序性細胞死亡蛋白(PD)1途徑抑制腫瘤免疫，其機制有待深入研究〔15,16〕。本研究結(jié)果表明松果體的存在能抑制乳腺癌組織中Foxp3+Treg細胞的產(chǎn)生，松果體分泌的MLT對乳腺癌組織中Foxp3+Treg細胞的產(chǎn)生具有抑制作用，但研究結(jié)果未顯示該作用的劑量依賴性，相對于外周血的劑量影響效應(yīng)，在癌組織中可能需要更大幅度的MLT劑量變化才會出現(xiàn)抑制Treg細胞生成效應(yīng)的變化，相關(guān)效應(yīng)變化分析及是否與癌組織中的血瘤屏障有關(guān)尚需進一步研究。

綜上，乳腺癌的發(fā)生與Treg細胞的生成密切相關(guān)，而松果體及其MLT能通過抑制Treg細胞的生成，改變荷乳腺癌機體的免疫狀態(tài)，調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，有利于減弱腫瘤的免疫逃避能力，因此MLT有望通過機體的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗乳腺癌的作用。